基于PI3K/AKT/mTOR信号通路探讨阳和汤含药血清对人乳腺癌细胞增殖、凋亡的影响

摘要

目的：通过体外实验研究，探讨阳和汤大鼠含药血清对人乳腺癌细胞MDA-MB-231的作用及其作用机制；探寻阳和汤干预PI3K/AKT/mTOR信号通路的作用靶点和作用规律，为临床使用阳和汤诊治乳腺癌提供理论依据。 方法：制备阳和汤药液（熟地30g、肉桂3g、麻黄2g、鹿角胶9g、白芥子6g、姜炭2g、生甘草3g、土贝母15g），40只SD大鼠随机分为4组：分别为正常血清对照组和阳和汤低、中、高剂量组。分别以人用量的5、10、20倍的浓度灌胃给药，正常血清对照组给予同样体积的生理盐水进行灌胃，分别制备低、中、高三组浓度的含药血清；并使用同样方式制备对照组的血清。分别将各组血清干预于人乳腺癌MDA-MB-231细胞上：采用CCK-8法观察各组血清在干预MDA-MB-231细胞24h、48h、72h后对细胞生长的抑制作用，流式细胞仪检测上述含药血清在干预MDA-MB-231细胞48h时后对细胞周期分布和凋亡的影响。采用Western blot法检测各组血清在干预MDA-MB-231细胞48h后对细胞中total PI3K、p-PI3K、total AKT、p-AKT、PTEN、total mTOR、p-mTOR等蛋白表达水平的影响。 结果： 1.阳和汤低、中、高剂量含药血清作用于乳腺癌MDA-MB-231细胞24h，其细胞生长抑制率分别为0.8％、8.19%、12.04%。作用48h，其细胞生长抑制率分别为11.05%、27.28%、51.75%。作用72h，其细胞生长抑制率分别为2.95%、42.28%、75.49%。阳和汤低剂量组在作用细胞48h时，其吸光度与对照组相比降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），阳和汤中、高剂量组在作用细胞48h和72h后与正常血清对照组相比，其吸光度明显降低，具有显著的统计学差异（P＜0.01）。 2.不同剂量组在10％的含药血清干预细胞48h后，与对照组比较，G0/G1期的比例分别为74.51%、67.93%、60.43%、52.12%；S期所占比例分别为14.12%、13.53%、16.06%、14.94%；G2/M期所占的比例分别为11.36%、18.53%、23.51%、32.97%；将阳和汤各组的三个周期分别与对照组进行两两比较可见：三组阳和汤血清组的G2/M期所占据的比例和对照组相比都较高，有明显的统计学差异(P＜0.05或P＜0.01)。此结果提示阳和汤含药血清对细胞周期分布的影响主要为将细胞阻滞于G2/M期。 3.不同剂量组在10％的含药血清干预细胞48h后，各组凋亡细胞所占的比例，与对照组进行两两比较，检测结果显示，阳和汤低、中、高剂量血清组的凋亡率在作用48h时分别为5.97%、7.68%、9.60%，均高于对照血清组，有显著统计学意义(P＜0.01)。 4.用不同剂量阳和汤含药血清干预人乳腺癌MDA-MB-231细胞48h后，结果显示，随着血清中阳和汤浓度的增加，细胞中PI3K、Akt和mTOR蛋白的磷酸化水平均逐渐降低，差异具有统计学意义（P＜0.05)；而PTEN蛋白的表达随着浓度的增加而增加，差异具有统计学意义（P＜0.05)。证明在蛋白水平，阳和汤含药血清对抑制PI3K、Akt和mTOR蛋白的磷酸化和促进PTEN蛋白表达方面呈浓度依赖性。 结论：阳和汤大鼠含药血清可明显抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖，可以促使MDA-MB-231细胞发生凋亡，可将细胞周期阻滞于G2/M期，减弱p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白的表达，促进PTEN蛋白的表达，上述结果具有着一定的时间-剂量依赖性。这表示阳和汤有一定的抗乳腺肿瘤的作用效果，其机制可能与抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路上相关蛋白的磷酸化水平，从而阻滞细胞周期、加快细胞调亡，最终发挥出抗肿瘤的效果。