基底应力松弛对不同分化阶段成肌纤维细胞分化的影响

摘要

成肌纤维细胞是一种超微结构介于成纤维细胞和平滑肌细胞之间的细胞，具有合成分泌和收缩两项功能。近期研究表明成肌纤维细胞在愈伤反应中起着十分重要的作用，并参与生物体内多种器官的纤维化过程。
　　 本文在总结以往研究者工作的基础上，以1.5kg新西兰兔为试验对象，以自主研发的能实现对细胞进行特定力学加载的细胞应力加载装置为背景，采用异源蛋白植入法获得实验所需细胞，进而对培养的原代成肌纤维细胞施以不同大小的基底应力松弛(6％-0，6％-3％-0)，同时结合使用不同应力状态的静态细胞培养(0预应力静态基底，6％预应力静态基底)为对照组，使用生物力学、细胞生物学、免疫组织化学、计算机图像处理等多种研究方法，研究在不同的力学过程中成肌纤维细胞生长，分化的变化情况。使用ANSYS、MATLAB等软件对试验中涉及到的基底力学情况进行分析，得到详尽的应力应变变化规律。通过总结试验结果对成肌纤维细胞的分化程度进行讨论，指出基底松弛所产生的应力应变变化趋势对成肌纤维细胞的分化是起到促进作用的。主要工作和得出的相应结论如下：
　　 ①通过将异源蛋白植入动物腹腔，经过3～15天，通过动物自身免疫反应，可得到由一层间皮细胞包裹的成肌纤维细胞，经消化、分离，可以得到大量的成肌纤维细胞。
　　 ②通过对放置天数的人为控制可以得到不同分化阶段的成肌纤维细胞。放置三天可获得成肌纤维细胞前体；放置五天到七天可以得到成肌纤维细胞；放置十天以上，细胞向成肌纤维细胞方向分化更为明显，α-SM-actin表达量较5～7天有明显增加。
　　 ⑨成肌纤维细胞的细胞分化是呈阶段性的。在三天以前，以成肌纤维细胞前体的形式存在，细胞不表达成肌纤维细胞的标志性蛋白α-SM-actin；当放置时间延长至五天到七天时，细胞开始表达α-SM-actin，细胞形态呈现一定的多边性，但五天，七天的细胞经检测不存在生物学上的差异；当放置时间延长至十天到十五天时，细胞大量表达α-SM-actin，且呈丝状排列，细胞形态呈明显的多边形。
　　 ④对五天和七天的细胞实施6％-3％-0和6％-0应力松弛时，可明显促进细胞向着成肌纤维细胞的方向分化。
　　 ⑤应力变化会对成肌纤维细胞的分化产生明显的影响，但有预应力存在，而未发生任何变化的基底对成肌纤维细胞的分化程度是不起生物学效应的。
　　 ⑥利用有限元分析方法分析试验所采用的细胞培养环境可知：当细胞基底从6％形变松弛到O形变时，硅胶膜上生长的成肌纤维细胞所经历的等效应力变化为0.3～0.34kPa，等效应变变化为0.030～O.034m/m；当细胞基底从3％形变松弛到0形变时，硅胶膜上生长的成肌纤维细胞所经历的等效应力变化为O.15～O.17kPa，等效应变变化为0.06～O.068m/m。
　　 ⑦利用有限元分析方法对有裂口和没有裂口的两种情况下的四组硅胶膜受力情况进行分析比较得出：硅胶膜上各点受力的统一化程度与硅胶膜的完整性呈正相关，与形变的大小呈负相关。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词一览表

声明

1绪论

1.1问题的提出

1.2国内外研究现状

1.2.1成肌纤维细胞的组织学特点和类型

1.2.2成肌纤维细胞的生物学作用

1.2.3影响成肌纤维细胞分化的主要因素

1.2.4细胞骨架对力学信号的反应

1.3本文研究目的、意义及主要内容

1.3.1本文研究目的及意义

1.3.2本文研究的主要内容

2原代成肌纤维细胞的获得与鉴定

2.1引言

2.2成肌纤维细胞获取的动物模型

2.3实验材料、试剂和仪器设备

2.3.1实验材料

2.3.2主要实验试剂

2.3.3主要实验试剂的配置方法

2.3.4主要仪器、耗材

2.4实验方法

2.4.1原代成肌纤维细胞的获得

2.4.2荧光染色法鉴定成肌纤维细胞

2.4.3目的蛋白的SDS-PAGE电泳检测

2.4.4蛋白的免疫印迹(Western Blotting)分析

2.5实验结果

2.5.1检测α-SM-actin抗体的活性

2.5.2免疫荧光法对原代成肌纤维细胞进行鉴定

2.5.3免疫印迹法对原代成肌纤维细胞进行鉴定

2.6结果分析

2.6.1检测α-SM-actin抗体的活性

2.6.2免疫荧光法对原代成肌纤维细胞进行鉴定

2.6.3免疫印迹法对原代成肌纤维细胞进行鉴定

2.7本章小结

3异源蛋白植入法获得的成肌纤维细胞分化起始时间的测定

3.1引言

3.2实验材料、试剂和仪器设备

3.2.1实验材料(同2.3.1)

3.2.2主要实验试剂(同2.3.2)

3.2.3主要实验试剂的配置方法(同2.3.3)

3.2.4主要仪器、耗材(同2.3.4)

3.3实验方法

3.3.1硅胶膜的处理

3.3.2不同阶段成肌纤维细胞的获得与培养

3.3.3荧光染色法分析不同分化阶段的成肌纤维细胞(同2.3.2)

3.4实验结果

3.5分析讨论

3.5.1细胞形态变化

3.5.2免疫荧光总强度变化

3.6本章小结

3.6.1细胞形态的变化和细胞内部变化是同步的

3.6.2成肌纤维细胞分化起始时间点

3.6.3成肌纤维细胞分化呈阶段性

4基底应力松弛对不同时期成肌纤维细胞分化的影响

4.1引言

4.2实验材料、试剂和仪器设备

4.2.1实验材料(同2.3.1)

4.2.2主要实验试剂(同2.3.2)

4.2.3主要实验试剂的配置方法(同2.3.3)

4.2.4主要仪器、耗材(同2.3.4)

4.3实验方法

4.3.1硅胶膜的处理(同3.3.1)

4.3.2不同阶段成肌纤维细胞的获得与培养(同3.3.2)

4.3.3细胞力学加载装置

4.3.4免疫荧光法对各组成肌纤维细胞进行分析(同2.4.2)

4.3.5蛋白的免疫印迹分析(同2.3.3和2.3.4)

4.4实验结果

4.4.1免疫荧光法对各组成肌纤维细胞进行分析

4.4.2蛋白的免疫印迹分析

4.5分析讨论

4.5.1细胞形态比较

4.5.2 T检验

4.5.3免疫印迹结果分析

4.6本章小结

4.6.1细胞形态的变化和细胞内部变化是同步的

4.6.2应力松弛对成肌纤维细胞起促进作用

5实验中弹性硅胶膜的力学分析

5.1引言

5.2硅胶膜单轴应变的定性分析

5.3 ANSYS软件介绍

5.4硅胶膜的拉伸特性分析

5.5硅胶膜的ANSYS有限元分析结果

5.6有限元结果分析

5.6.1位移分析

5.6.2等效应力分析

5.6.3等效应变分析

5.6.4等效应变与等效应力主体部分分析

5.7本章小结

6结论与展望

6.1主要结论

6.2后续工作展望

致 谢

参考文献

附 录 攻读硕士学位期间撰写及发表的论文