母源性BDE-209暴露对子鼠学习记忆能力的影响及突触可塑性的相关探讨

摘要

[背景]:1.关于PBDEs(多溴联苯醚) 多溴联苯醚(PBDEs)是一系列含溴原子的芳香族化合物。根据苯环上溴原子的个数和位置的不同，多溴联苯醚总共有209种同分异构体。可以作为阻燃剂添加入多种电子产品、塑料泡沫、装饰材料等产品之中。当这些产品报废后不经过严格的回收和后期处理，而随意废置于自然界，产品中的化学阻燃剂成分将进入人类的生存环境，且难以降解，构成了持续性有机污染物。可通过水气挥发、空气流动等途径在环境中传播，并进入食物链易在生物体包括人体的脂肪组织中富集，对人类及整个生态系统造成潜在的危害。 由于PBDEs结构类似于PCBs(多氯联苯醚—目前已被禁止生产使用)和甲状腺激素(生物神经发育过程中的关键激素之一)，从PBDEs开始使用至今，对其毒性的研究一直受到人们的关注。以往的研究主要为低溴类如BDE-99,47,153等，结果发现对生物毒性明显，可导致内分泌的紊乱、神经行为失常、其某些代谢物可能具有致癌性等。在母胎医学领域，目前认为PBDEs这些脂溶性的化合物均可以通过胎盘屏障和血脑屏障等进入胎儿体内或进入脑组织，以致胎儿脑组织的发育不良，因此在美国以及欧洲等地相继被限制生产及使用。但对高溴类如BDE-209所做探讨甚少。 2.关于BDE-209(十溴联苯醚) BDE-209是PBDEs家族中含溴最高的一种化合物，在全球范围内使用广泛。在中国，空气、水以及河流沉淀物中BDE-209的含量均高于西方国家同期水平。由于目前对BDE-209的毒性不确定，所以世界范围内仍在使用。现有的实验资料表明的观点有两种：(1)BDE-209对生物体是有害的，包括神经发育毒性，免疫毒性，内分泌毒性以及致癌性等，应该像低溴的阻燃剂一样被限制生产使用；(2)由于BDE-209在体内的代谢快，蓄积低，在常规暴露水平下对机体不造成影响。由于研究结果不一致，到目前为止，BDE-209对生物毒性影响依然未定。 所以，本课题根据BDE-209脂溶性强，环境含量高，生物暴露量大，毒性作用尚未确定的特点，建立BDE-209的母源性暴露动物模型，研究母鼠BDE-209暴露对子代鼠学习记忆能力的影响及突触可塑性的变化。本课题分为以下五个部分进行各项具体实验。 第一部分 母源性BDE-209暴露后血清BDE-209变化以及对子鼠学习记忆能力的影响 [目的]建立母源性BDE-209暴露的动物模型，检测子鼠断乳后学习记忆能力的变化，并分别测定母鼠以及子鼠血清BDE-209的浓度。 [材料与方法] 1.购买出生21天左右的SPF级wistar母鼠40只，公鼠20只。分为四组：实验组(A)：自购买日始母鼠胃灌PBDE-209直至生育第一代子鼠断乳；实验组(B)：自购买日始胃灌单纯花生油至妊娠，妊娠后改为胃灌BDE-209直至生育第一代子鼠断乳；实验组(C)：自购买日始胃灌单纯花生油至分娩新一代子鼠，仅在哺乳期胃灌PBDE-209；对照组(D)：自购买日始一直胃灌单纯等量花生油。 2.Y型迷宫检测各组子鼠(每组分别20只子鼠)成年后的学习记忆能力的变化。 3.Y型迷宫测试结束后，分别收集母鼠及子鼠的血清标本检测BDE-209的浓度。 [结果]1.子鼠学习记忆能力检测结果显示A组的大鼠学习记忆能力较对照组有明显的下降(P＜0.01)；B组较对照组的学习记忆能力有下降(P＜0.05)，记忆能力没有改变。C组与对照组比较学习记忆能力下降均不明显(P＞0.05)： 2.A组与B组，C组比较，学习记忆能力均有明显改变(P＜0.01)。B组与C组比较在学习记忆能力方面的差别不大，没有显著性差异。 3.母代鼠各组与子代各组的血清BDE-209的含量均随暴露时间的延长而增加，A组母代鼠血清含量最高，为885262ng/glw，相应子代为502392ng/glw，B组母代血清含量为540096ng/glw，而子代血清含量为338811ng/glw，对照组子代与母代的血清BDE-209的含量相近.分别为46244ng/glw和46206ng/glw。 [结论]1.母鼠长时间BDE-209暴露可以造成其子鼠学习记忆能力下降。 2.母鼠BDE-209暴露可以在体内有一定程度的生物蓄积作用，并且这种蓄积可以通过胎盘屏障或母乳进入胎鼠或新生鼠的体内，导致其间接的暴露。 第二部分 母源性BDE-209暴露对子鼠脑组织形态学的影响及突触超微结构的变化 [目的]观察BDE-209暴露的子鼠脑组织发育的情况，电镜下观察子鼠突触超微结构及数目的变化。 [材料与方法]1.组织标本及电镜标本的选取及制作。 2.尼氏染色下光镜观察子鼠脑组织的变化。 3.透射电镜下观察子鼠脑组织的结构及突触结构，数目的变化。 [结果]1.尼氏染色观察子鼠成年后的脑组织形态学变化不明显，未发现特殊结构的差异。 2.电镜下观察到实验组子鼠脑细胞及突触超微结构发生变化。 3.突触密度计数：各组大鼠子代海马CA3区分子层内突触密度的计数(个/70um2)结果显示，在母鼠接触BDE-209的过程中，A组与对照组(D)及其他各实验组比较差异均有显著性(P＜0.05)。B组、C组与对照组比较均无显著性差异，B组与C组之间差异不明显(P＞0.05)。 [结论]母鼠接触BDE-209可以导致子鼠脑神经细胞及突触超微结构发生改变，影响子鼠突触的形成发育，降低突触数目。 第三部分 母源性BDE-209暴露对成年子鼠海马区中微管相关蛋白1B(Map-1B)及突触体素(SYN1)表达的影响 [目的]了解母鼠BDE-209暴露对子鼠海马区微管相关蛋白1B(Map-1B)及突触体素(SYN1)的表达变化。 [材料与方法]1.组织标本的选取制作及蛋白的抽提。2.免疫组织化学的方法检测Map-1B及突触体素在海马组织中表达。3.蛋白印记实验检测Map-1B及突触体素在海马组织中表达的量的变化。 [结果]1.Map-1B在子代海马区的表达：A组的母鼠子代海马区MAP-1B的表达较对照组D组下降，差异有统计学意义(P＜0.05)，其余各实验组较对照组相比表达均有变化，但无明显的统计学意义。组间比较结果提示A组与B组、C组有显著性差异，B组与C组的差异不明显。 2.SYN1在子代海马区的表达变化：免疫组化及蛋白印记法检测实验结果显示：实验组A、B、C突触体素(SYN1)表达水平较同龄对照组(D)相比均有下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。组间比较A组与B组，C组有显著性差异，B组与C组的差异不明显。 [结论]母源性BDE-209暴露可导致出生后子鼠海马区Map-1B及SYN1的表达下降。长时间暴露可以使得Map-1B及SYN1的表达下降更为明显。 第四部分 RT-PCR检测母源性BDE-209暴露的子鼠海马区Map-1b、S100mRNA的变化 [目的]通过逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)的方法了解母鼠BDE-209暴露对子鼠海马组织中微管相关蛋白1b(Map-1b)及S100蛋白mRNA的表达变化。 [材料与方法]1.提取海马总RNA2.设计引物及合成(分别设计并合成Map-1b及S100mRNA的引物)。3.逆转录及PCR扩增。 [结果]1.海马区map-1bmRNA表达的变化：母鼠长期胃灌BDE-209(90天)(实验组A)海马组织中的map-1bmRNA下降，与对照组比较有显著性差异(P＜0.01)；组间比较结果提示实验组A与实验组B、C比较亦有显著性差异(P＜0.01)。其他各组表达均有下降，但数值无统计学意义。结果与蛋白印记定量表达一致。 2.实验组A的海马组织中S-100蛋白的表达较对照组增强，差异有统计学意义(P＜0.01)；其它各组均与对照组无明显差别。实验组A与其他各实验组B、C比较亦有显著性差异(P＜0.05)。B组与C组比较没有统计学差异。 [结论]母鼠长时间接触BDE-209可以导致所生子鼠的海马区MAP-1bmRNA表达下降；S-100mRNA的表达增高。 第五部分 母源性BDE-209暴露对子鼠不同年龄阶段海马区的Map-1b的表达变化 [目的]探讨母鼠BDE-209暴露对子鼠神经发育过程中不同年龄阶段海马区微管相关蛋白(Map-1b)的表达变化。 [材料与方法]1.以原有的A组(长期BDE-209的暴露组)为基础，保留20只A组的第一代子鼠为继续研究对象，同法胃灌BDE-209并使之生育第二代子鼠，取第二代新生鼠、出生14天鼠以及出生21天鼠各20只作为实验对象。 2.免疫荧光法检测第二代子鼠不同年龄段的Map-1b在海马区的表达变化。 3.蛋白印记实验检测第二代子鼠不同年龄段的Map-1b在海马区的表达。 [结果]免疫荧光及蛋白印记法检测结果提示：出生第1天，第21天的实验组子鼠MAP-1b表达较同龄对照组下降，差异有统计学意义(P＜0.05)，出生14天组与对照组的MAP-1b表达无明显差异(p＞0.05)。 [结论]母鼠长期接触BDE-209可使其子鼠在脑发育过程中海马区MAP-1b的表达下降。

目录

前 言

第一部分 母源性BDE-209暴露对子鼠学习记忆能力的影响及血清BDE-209浓度的测定

第二部分 母源性BDE-209暴露的子鼠脑组织发育及突触超微结构及数目的观察

第三部分 母源性BDE-209暴露对子鼠海马组织中Map-1B及突触体素(SYNI)的表达变化

第四部分 RT-PCR检测母源性BDE-209暴露的子鼠海马区Map-1B、S100mRNA的变化

第五部分 母源性BDE-209暴露对子鼠不同年龄阶段海马区的Map-1b的表达变化

小结

缩略词表

主要参考文献

附综述一 关于PBDEs和BDE-209的研究及其对神经发育的影响

附综述二 学习记忆与突触可塑性及相关蛋白的研究进展

附论文 A bsence of part of hindlimb or tail induced by PBDE-209 in rats

研究生在读期间已发表的文章

致谢

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