T淋巴细胞相关协同刺激分子在重症肺炎发病机制中的作用研究

摘要

重症肺炎目前具体的发病机制不详。研究发现重症肺炎患者淋巴细胞显著减少，并与患者的预后密切相关。是什么导致重症肺炎淋巴细胞减少？研究表明重症肺炎患者外周血中协同刺激分子表达异常，可能导致T淋巴细胞处于“免疫无能（anergy）”状态。其中是因为T淋巴细胞相关的协同刺激分子CD28，CD152及CD86等的表达异常，还是因为CD28/CD152这对相互拮抗的信号分子的比例异常导致了T淋巴细胞处于“免疫无能”状态？目前尚不清楚。研究发现胸腺肽-α1（Tα1）在机体免疫应答过程中起着重要的作用，并认为其可能是通过增强T淋巴细胞功能而调节免疫系统的。研究观察到胸腺肽a1可以改善脓毒性休克患者的T淋巴细胞增殖，调节机体的细胞免疫功能。可见，胸腺肽a1有调节机体免疫异常的功能，是否通过调控协同刺激信号来影响T淋巴细胞的增殖？尚待进一步的研究。 目的: 在蛋白水平上研究重症肺炎T细胞相关协同刺激分子与其细胞增殖能力的关系，以探讨该病的发病机制；在此基础上，观察胸腺肽-α1对重症肺炎T淋巴细胞协同刺激分子及其细胞增殖能力的影响，并进一步探讨T淋巴细胞协同刺激分子在重症肺炎免疫异常中的可能作用。 资料和方法: 1.标本来源 2007年8月-2008年06月入住广州市第一人民医院呼吸科的重症肺炎患者，均符合美国胸科学会（ATS）于2007年制定的重症肺炎诊断标准。健康对照组来自同期门诊健康体检者。经本人及家属知情同意后抽取外周静脉血。重症肺炎患者21例，抽血2mL，EDTA-K3抗凝；其中11例多抽血13mL，肝素抗凝；另外其中11例于住院治疗后10天再次抽血2mL（其中28天患者预后为8例好转、3例死亡）。健康人12名抽血2mL，EDTA-K3抗凝；其中10名多抽血8mL肝素抗凝。 2.方法: 2.1 T淋巴细胞相关协同刺激分子的检测：取EDTA-K3抗凝血标本。设测定管及同型对照管。检测T淋巴细胞上的四个表位（CD4，CD8，CD28，CD152）及相关的单核细胞的两个表位（CD86，HLA-DR）。用FITC、PE、PC5、APC和APCcy7荧光素直接标记单克隆抗体。检测前校准流式细胞仪的光路和液路。将光路调整至最佳，检测阴性对照，调整电压和颜色补偿。利用FACScan及CELLQuest软件收集分析数据。使用前向角散射光侧向角散射光双参数设门。收集10000个细胞。以百分率表示每群细胞的表达。 2.2 T淋巴细胞的增殖试验 2.2.1人外周血单个核细胞（PBMC）提取：密度梯度离心法提取重症肺炎病人及健康人的外周血标本（PBMC）。立即使用或冻存，用前溶解。 2.2.2单个核细胞（PBMC）PKH26染色及培养：参考PKH26染料说明书对PBMC进行染色。重悬成1×106/ml的浓度，接种于24孔培养板孔中。实验分为4组：①空白对照组PBS+PKH26染色后PBMC；②阳性对照组PHA+PKH26染色后PBMC；③胸腺肽-α1+内毒素+PKH26染色后PBMC；④内毒素PKH26+染色后PBMC。每孔终体积约0.6 ml浓度1×106/ml，在37℃、5%CO2条件下培养5天。 2.2.3 T淋巴细胞增殖的检测：取出培养5天后的PKH26染色细胞，分两管，每管0.3ml，离心洗涤，加入荧光素标记的PC5-CD31μg/106细胞，混匀后室温暗处孵育，洗涤后，用2 g/L多聚甲醛固定，利用流式细胞仪检测及数据用CELLQuest软件和ModFitTM软件分析得到T淋巴细胞的增殖指数（PF）及增殖细胞的前体频率（PI）。 2.2.4体外培养T淋巴细胞及协同分子的检测：取未染色的单个核细胞，重悬成1×106/ml的浓度，接种于24孔培养板孔中。实验分为4分组：①空白对照组PBS+未染色PBMC；②阳性对照组PHA+未染色PBMC；③胸腺肽-α1+内毒素+未染色PBMC；④内毒素+未染色PBMC。每孔终体积约0.6 ml，浓度1×106/ml，在37℃、5%CO2条件下培养5天。取出培养5天后未染色的细胞，分两管，每管0.3ml，离心洗涤，加入荧光素标记的FITC-CD28/PE-CD152/PC5-CD3各1μg/106细胞，混匀后室温暗处孵育，洗涤后，用2g/L多聚甲醛固定，利用流式细胞仪检测及数据用CELLQuest软件分析协同刺激分子CD28、CD152的表达。 2.3统计学方法：所有实验数据均用SPSS11.5软件分析，计量资料以均数±标准差（X±S）表示，两组均数比较采用t检验。随机区组设计资料采用方差分析，用LSD法进行数据问的多重比较，取P<0.05差异有统计学意义。 结果: 1.重症肺炎T淋巴细胞、亚群及相关协同刺激分子：21例重症肺炎患者CD3、CD4、CD86、HLA-DR、CD28/CD152、CD4/CD8较12例健康对照组减少，有统计学显著性差异（P<0.05）； CD8、CD28，CD152表达较健康对照组增加，有统计学显著性差异（P<0.05）。 2.28天存活组重症肺炎患者治疗前后（10天）T淋巴细胞、亚群及相关协同刺激分子的变化：存活组8例重症肺炎入院第10天和第1天比较APACHEⅡ评分显著减少（P=0.000）； CD28、CD152、CD86、HLA-DR的表达显著升高（P<0.05）；CD3T细胞也显著增加（P=0.030）； CD8CD3，CD4CD3阳性的T细胞无显著变化（P>0.05）。 3.PKH26标记重症肺炎患者外周血单个核细胞（PMBC）的情况：PKH26标记PMBC，在直方图上PKH26荧光强度出现明显右偏，达104，呈单峰，阳性率为96.48%。荧光显微观察PKH26标记后的PMBC，可见其细胞发红色荧光。 4.重症肺炎患者外周血T淋巴细胞对抗原刺激的增殖能力：10例重症肺炎患者外周血T淋巴细胞对内毒素（LPS）刺激的增殖指数PI（1.55±0.42）与增殖细胞的前体频率PF（0.02±0.01）低于10例健康人组的PI（2.15±0.29）与PF（0.04±0.02），有统计学差异（P<0.05）。 5.胸腺肽-α1对重症肺炎外周血T淋巴细胞增殖的影响 5.1光学显微镜观察胸腺肽-α1对重症肺炎外周血T淋巴细胞增殖的影响：不同干预因素组重症肺炎外周血T淋巴细胞在体外培养5天后，用显微镜观察（×10倍），可见PHA组及胸腺肽-α1加内毒素组出现明显的淋巴细胞母细胞化，其他两组未见明显的淋巴细胞母细胞化。 5.2胸腺肽-α1对重症肺炎外周血T淋巴细胞增殖的影响：10例重症肺炎PHA组、胸腺肽-α1加内毒素组及内毒素组T淋巴细胞的增殖细胞的前体频率（PF）分别为：0.03±0.03、0.03±0.02、0.02±0.01；T淋巴细胞的增殖指数（PI）分别为：1.68±0.49、1.84±0.53、1.55±0.42。胸腺肽-α1加内毒素组T淋巴细胞的增殖指数与增殖细胞的前体频率比内毒素组的高，有统计学显著性差异（P<0.05）；胸腺肽-α1加内毒素组T淋巴细胞的增殖指数及增殖细胞的前体频率与PHA组的比较，无统计学显著性差异（P>0.05）。 6.胸腺肽-α1对重症肺炎外周血T淋巴细胞协同刺激分子的影响 6.1胸腺肽-α1对重症肺炎外周血T淋巴细胞CD28协同刺激分子的影响：PBS组（67.40±6.45）%、PHA组（72.21±7.05）%、胸腺肽-α1加内毒素组（73.70±8.66）%及内毒素组（66.94±11.85）%。胸腺肽-α1加内毒素组T淋巴细胞CD28协同刺激分子的表达比内毒素组及PBS组的高，有统计学显著性差异（P<0.05）；胸腺肽-α1加内毒素组T淋巴细胞CD28协同刺激分子的表达与PHA组的比较，无统计学显著性差异（P=0.479）。 6.2胸腺肽-α1对重症肺炎外周血T淋巴细胞CD152协同刺激分子的影响：PBS组（3.01±1.08）%、PHA组（2.69±1.23）%、胸腺肽-α1加内毒素组（2.41±0.77）%及内毒素组（2.86±1.03）%。胸腺肽-α1加内毒素组T淋巴细胞CD152协同刺激分子的表达比内毒素组及PBS组的低，有统计学显著性差异（P<0.05）；胸腺肽-α1加内毒素组T淋巴细胞CD152协同刺激分子的表达与PHA组的比较，无统计学显著性差异（P=0.306）。 6.3胸腺肽-α1对重症肺炎外周血T淋巴细胞协同刺激分子CD28/CD152比值的影响：PBS组（25.26±9.57）、PHA组（31.38±11.67）、胸腺肽-α1加内毒素组（33.30±9.96）及内毒素组（21.13±5.39）。胸腺肽-α1加内毒素组T淋巴细胞协同刺激分子CD28/CD152的比值比内毒素组及PBS组的大，有统计学显著性差异（P<0.05）。 结论: 1.重症肺炎患者外周血T淋巴细胞存在“免疫无能”，导致了T淋巴细胞及CD4亚群减少，抑制了机体的免疫功能。 2.T淋巴细胞相关协同刺激分子CD28、CD152及CD86表达异常参与了重症肺炎发病的病理生理过程。 3.体外胸腺肽-α1可通过调节重症肺炎患者外周血T淋巴细胞协同刺激分子CD28、CD152表达；来改善其对抗原刺激的增殖能力。

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论文说明：缩略词表

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研究背景

第一部分T淋巴细胞相关协同刺激分子与重症肺炎免疫异常的关系研究

1资料和方法

2结果

3讨论

第二部分胸腺肽-α1对重症肺炎患者外周T淋巴细胞增殖及协同刺激分子的影响

1资料和方法

2结果

4讨论

结论

参考文献

综述 CD28：CTLA4/B7协同刺激分子在脓毒症发病机制中的作用

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