P-gp底物和抑制剂结合模式与作用机理

摘要

由ABC（ATP-binding cassette）转运蛋白家族的多药耐药蛋白P-glycoprotein（P-gp）介导的药物外排是引发肿瘤细胞多药耐药（Multidrug resistance，MDR）的重要原因。抑制P-gp的药物外排功能已成为当前临床克服MDR的重要策略之一。因此，P-gp底物和抑制剂的结合模式与作用机理研究对于探索肿瘤细胞耐药机制以及抗肿瘤药物研发具有重要的理论意义和应用价值。迄今为止，由于缺乏人类P-gp蛋白的三维结构及实验技术手段的制约，其底物结合模式与转运机理仍然未知。论文采用定量构效关系（Quantitative structure-activity relationship,QSAR）、分子对接（Molecular docking）和分子动力学（Molecular dynamics,MD）模拟等计算生物学理论与方法，对P-gp底物和抑制剂的分子识别、结合模式、结合通路以及作用机理进行了系统研究，并取得了阶段性研究成果，主要包括：
　　①采用显露化学模式（Emerging chemical patterns,ECP）以及聚合显露模式分类算法（Classification by aggregating emerging patterns,CAEP）建立了P-gp底物分子识别模型。研究结果显示：最优ECP模型对803个训练集样本、120个测试集样本和179个独立的外部验证集样本的预测准确度分别达到了0.80、0.81和0.74。最优模型仅涉及3个关键的分子结构信息，其预测准确性和可解释性均优于已有模型。对P-gp底物18个ECP的聚类分析得到2组ECP集合（ECP group,ECPG），即ECPG1和ECPG2。结合部分底物的结合位点信息，发现具有ECPG1模式特征的底物倾向结合H位点，而具有ECPG2模式特征的底物倾向结合R位点。因此，论文所建ECP模型既可以识别底物分子，同时还可根据分子的ECP特征推测底物可能的结合位点。
　　②采用ECP和CAEP分类算法建立了P-gp抑制剂分子识别模型。从857个训练集样本中选取7个抑制剂和27个非抑制剂样本，并基于3个关键的分子结构特征建立了最优ECP模型。研究结果显示：最优模型对857个训练集样本和418个测试集样本的预测准确度分别为0.80和0.86；对2个独立的外部验证集的预测准确度则分别达到0.70和0.80。ECP特征分析发现：
　　1）HTv（H total index weighted by atomic van der Waals volume）是区分P-gp抑制剂与非抑制剂的重要分子特征；
　　2）多数抑制剂分子倾向与底物的H位点发生结合。比较研究发现：P-gp底物和抑制剂在mLogP（Moriguchi octanol-water partition coefficient）、tPSA（Total polar accessible surface area）和nHacc（The number of H-bond acceptors）3个分子性质的分布上具有显著性差异，上述差异可作为P-gp底物和抑制剂识别的重要特征。
　　③基于2个空载状态下的小鼠P-gp晶体结构（PDB ID:4M1M,4Q9H），采用Surflex-Dock方法对441个底物和666个抑制剂进行了分子对接研究。结果显示：底物和抑制剂在对接得分上无显著性差异，表明对接得分无法区分底物与抑制剂。相比之下，抑制剂倾向与疏水性氨基酸残基发生非特异性相互作用，而底物则更倾向与极性氨基酸残基发生特异性静电作用。与此同时，对于同一种受体构象，P-gp底物和抑制剂的结合位点基本相同。此外，利用已知结合位点的8个P-gp底物，论文对2种构象下H和R位点的空间位置进行比较分析。结果表明：对于2种P-gp受体构象，H和R位点的位置有明显差异。以上研究证实，由于空载状态下P-gp构象具较大柔性，P-gp可能包含多个H和R位点。
　　④应用PNEB（Partial nudged elastic band）模拟方法对P-gp底物和抑制剂的结合通路进行了研究。结果表明：位于磷脂双分子层的底物和抑制剂，可经由TM4和 TM6形成的通道进入 P-gp结合空腔。MM/GBSA结合自由能分析表明，底物Rhodamine-123和抑制剂QZ-Leu从磷脂双分子层进入结合空腔是一个自发过程。动力学轨迹分析结果显示：对于大体积的抑制剂QZ-Leu，TM4的构象发生了极为显著的改变，表明TM4的结构柔性对大体积分子的结合具有重要的调控作用。同时，在底物Rhodamine-123和抑制剂QZ-Leu的结合过程中，位于TM6的Phe339侧链均发生了明显的旋转，暗示Phe339可能对分子结合通路的打开或关闭具有重要的门控作用。
　　⑤采用分子动力学模拟对P-gp底物和抑制剂的作用机理进行了研究。研究结果显示：当结合底物Rhodamine-123时，位于2个ATP结合位点的保守氨基酸残基（Lys和Ser）间的距离相对减小，暗示底物的结合可促使NBD1和NBD2相互靠近，有利于NBD的二聚化和ATP水解位点的形成。而抑制剂QZ-Leu的结合则导致NBD1和NBD2间的距离显著增大，ATP结合位点更加开放。结果表明：底物和抑制剂的结合对NBDs的构象具有重要影响。MM/GBSA结合自由能计算结果表明，抑制剂QZ-Leu与P-gp的亲和活性较底物Rhodamine-123更高，据此推测抑制剂的高亲和活性对维持P-gp的NBDs的开放构象和抑制ATP水解活性有利；而底物相对的低亲和活性则可能有利于后续的跨膜转运过程。
　　总的来说，论文的研究结果可为P-gp底物和抑制剂的虚拟筛选、相关抗肿瘤药物研发以及P-gp底物和抑制剂的作用机理研究提供重要的参考依据。

目录

1 绪 论

1.1 P-gp三维结构研究进展

1.2 P-gp构象变化研究进展

1.3 P-gp底物结合与跨膜转运机理研究进展

1.4 P-gp计算模拟研究进展

1.5论文的主要研究内容

1.6 创新性与研究意义

2 原理与方法

2.1 ECP建模

2.2 分子对接

2.3 分子动力学模拟

3 P-gp底物分子识别与结合模式

3.1 数据集来源

3.2结构表征和变量筛选

3.3 ECP建模和模型验证

3.4 结果与讨论

3.5 小结

4 P-gp抑制剂分子识别与结合模式

4.1 数据集来源

4.2 结构表征

4.3 ECP建模和模型验证

4.4 结果与讨论

4.5 小结

5 P-gp底物和抑制剂的分子对接与作用模式研究

5.1 数据来源与处理

5.2 分子结构准备

5.3 Surflex-Dock对接参数设置

5.4 结果与讨论

5.5 小结

6 P-gp底物和抑制剂的结合通路与自由能预测

6.1 数据来源

6.2 结构准备

6.3 端点结构的优化

6.4 PNEB模拟和结合自由能计算

6.5 结果与讨论

6.6 小结

7 底物和抑制剂结合对P-gp构象变化的影响

7.1 结构来源与准备

7.2 分子动力学模拟

7.3结合自由能计算

7.4 结果与讨论

7.5 小结

8 结论与展望

8.1 研究结论

8.2 前景展望

致谢

参考文献

附录

A. 支持材料

B. 发表论文