微柱阵列型拓扑基底对SH-SY5Y细胞VGCC功能响应性影响及其机制的初步探究

摘要

为探究微柱阵列型拓扑基底用于调控细胞VGCC功能响应性的可行性，为以VGCC为靶标的新型药物筛选平台的构建提供必要的理论支撑。本文利用微加工技术制备了直径为2μm和4μm，间距为2μm和7μm，高度为4μm的PLLA微柱阵列基底，利用扫描电子显微技术与荧光定量技术研究了微柱阵列基底对SH-SY5Y细胞形态、骨架与粘着斑蛋白的影响，利用MTS研究了SH-SY5Y细胞在微柱阵列基底上的增殖活性，结合钙离子染料Calcium Green-1AM与激光共聚焦技术研究了微柱阵列基底对SH-SY5Y细胞VGCC功能响应性的影响，利用qPCR技术与荧光定量技术研究了VGCC在mRNA层次与蛋白层次的表达在VGCC功能响应微柱阵列基底中的作用，改进了TMRM法测定细胞膜电位的方法并研究了细胞膜电位在VGCC功能响应微柱阵列基底中的作用。
　　研究结果显示，微柱阵列基底对SH-SY5Y细胞的形态具有非常显著的影响，当细胞在小而密的微柱上时，细胞倾向于浮于微柱顶部生长，细胞圆度较大，随着微柱间距的增大，细胞陷于微柱中，粗的微柱阻碍细胞铺展，而细的微柱为细胞提供了黏附点，促进细胞铺展，甚至有微柱刺入细胞质或细胞核中，然而这种细胞形态的变化并没有对细胞增殖产生显著影响。与细胞在平面基底上相比，在微柱基底上细胞粘着斑与骨架分布的典型特征是围绕微柱或于微柱顶端集中表达，微柱的存在破坏了细胞骨架分布的有序性。SH-SY5Y细胞VGCC功能响应性在平面、2-2与2-7基底上差异显著，这种变化趋势与细胞铺展面积变化趋势存在一定相关性，细胞铺展面积越大，VGCC功能响应越强，然而这种VGCC功能响应性差异并不与VGCC通道表达差异所对应，在细胞铺展面积大的基底上，VGCC通道的表达反而趋向于降低。本实验改进了利用TMRM测定膜电位时，细胞核非特异性吸附的拟合方法，提高了计算精度。测量结果表明虽然微柱阵列基底对细胞膜电位具有显著影响，但这种变化并不与VGCC功能响应性差异所对应。
　　实验结果表明，利用微柱阵列基底调控细胞VGCC功能响应性是完全可行的，但对于要实现以微柱阵列基底为基础的以VGCC为靶标的药物筛选平台的构建，还依赖于对微柱基底的精确设计与机理研究。

目录

主要缩略词

1 绪 论

1.1 问题的提出与研究意义

1.2 国内外研究现状

1.3 研究目的和研究内容

1.4 技术路线

1.5 创新点

2 PLLA微柱阵列基底的制备及与SH-SY5Y细胞的复合

2.1 引言

2.2 实验仪器与材料

2.3 实验方法和步骤

2.4 实验结果

2.5 讨论和分析

2.6 本章小结

3 PLLA微柱阵列基底对SH-SY5Y细胞电压门控式钙离子通道功能响应性影响

3.1 引言

3.2 实验材料与仪器

3.3 实验方法和步骤

3.4 实验结果

3.5 讨论和分析

3.6 本章小结

4 PLLA微柱阵列基底对SH-SY5Y细胞电压门控式钙离子通道表达的影响

4.1 引言

4.2 实验材料与仪器

4.3 实验方法和步骤

4.4 实验结果

4.5 讨论和分析

4.6 本章小结

5 PLLA微柱阵列基底对SH-SY5Y细胞膜电位的影响

5.1 引言

5.2 实验材料与仪器

5.3 实验方法和步骤

5.4 实验结果

5.5 讨论和分析

5.6 本章小结

6 结论与展望

6.1 主要结论

6.2 后续工作展望

致谢

参考文献

附录

A. 作者在攻读学位期间发表的论文目录

B. 作者在攻读硕士学位期间参加的科研项目情况