混合物铜(Ⅱ)-2-巯基苯并噻唑的体外抗肿瘤作用及其机制的研究

摘要

背景与目的：
　　蛋白质是一切生命的物质基础，是机体细胞的重要组成部分，而所有的蛋白质几乎都处于不断地合成和降解的动态平衡之中。其中蛋白质的降解主要有2种途径：第一是溶酶体途径，它主要负责细胞外的蛋白质和膜蛋白的降解；第二是泛素-蛋白酶体途径，而它是主要负责真核细胞内绝大多数蛋白质的降解，并且能够快速、有序、特异、单向参与细胞体内许多重要的生理生化过程(如细胞增殖，分化，凋亡，DNA修复、细胞周期的运转、蛋白的跨膜定位等)。泛素-蛋白酶体通路的异常和机体的多种疾病相关，其中（如致癌基因蛋白/生长促进因子，CyclinB和HIF等的降解受阻或者抑癌基因蛋白P27和P53的降解加速使细胞生长失控）可以促使肿瘤的发生。该领域的研究引起了全世界的关注，研发有效的和特异的调控蛋白酶体的药物，成为抗肿瘤药物的新靶点。近年来的研究发现,某些金属配合物能够较强的抑制肿瘤细胞中蛋白酶体活性并能诱导肿瘤细胞凋亡，而且对永生化的正常细胞无毒性作用。这为临床上研发新型的蛋白酶体抑制来抗肿瘤开辟了新的道路。本实验通过研究二巯基苯并噻唑与铜（II）盐以2:1比例混合在不同肿瘤细胞系上诱导细胞凋亡及影响凋亡的因素来初步探讨抗肿瘤作用与蛋白酶体之间的关系，以及筛选出螯合剂二巯基苯并噻唑与金属离子铜形成配合物的最佳配比。
　　实验方法：
　　（一）体外抗肿瘤作用及其影响因素
　　1.细胞增殖检测。MTS法
　　2.细胞死亡检测
　　（1） Annexin V-FITC-PI流式细胞术
　　（2）荧光显微镜活细胞动态监测系统
　　3.检测死亡相关蛋白变化情况Western blotting
　　4.蛋白酶体活性检测细胞内蛋白酶体酶活性的检测
　　（二）抗肿瘤作用与蛋白酶体功能关系的研究
　　1.蛋白酶体活性检测细胞内蛋白酶体酶活性的检测
　　2.检测相关蛋白变化情况Western blotting
　　实验结果：
　　（一）研究铜（II）-2-巯基苯并噻唑混合物对稳定转染的GFPu-HEK293细胞的蛋白酶体的抑制作用
　　选用稳定转染过GFPu的HEK293细胞为研究对象进行处理，将蛋白酶体抑制剂MG1322.5(μM)作为阳性对照,MT单独作用于细胞的浓度分别为30、60、90（μM），CuCl2单独作用于细胞的浓度为15、30、45（μM）以及MT和CuCl2以2:1的比例作用于细胞12小时后：
　　（1）荧光显微镜活细胞动态观察拍照：结果显示MG132阳性对照组可看到绿色荧光，MT和CuCl2以2:1比例作用后可看到绿色荧光逐渐增多，呈浓度依赖性；并且形态学死亡加重呈浓度依赖性。
　　（2）收集细胞，裂解细胞抽提总蛋白进行Western blot蛋白测定。结果显示：反应UPS系统功能的内源性蛋白Ub,外源性蛋白GFPu在MT和CuCl2以2:1的浓度下开始出现聚集，并且呈现浓度依赖性。
　　（二）研究药物铜-2-巯基苯并噻唑混合物诱导不同种肿瘤细胞死亡，其敏感性不同
　　选用人骨髓瘤细胞NCI-H929和人骨髓瘤细胞U266为研究对象进行处理，MT以不同浓度30、60、90（μM），CuCl2以不同浓度15、30、45（μM）以及MT和CuCl2以2:1比例的混合物分别作用于2种细胞48小时后：采用MTS法检测到上述混合物作用于细胞后能够明显抑制细胞增殖，并且存在浓度依赖关系。同等条件处理这2种细胞36小时后，Annexin V-FITC-PI流式细胞术检测细胞的死亡情况，发现上述混合物作用于细胞后能够明显诱导细胞死亡，并且存在浓度依赖性。采用荧光显微镜活细胞动态观察拍照，观察到上述混合物作用于细胞能够明显诱导细胞死亡，并且存在浓度和时间依赖性。采用Western blotting检测到细胞死亡的相关蛋白 PARP,发现上述混合物作用于细胞后能够引起明显的PARP的切割，并且存在浓度和时间依赖性。
　　选用人肝癌细胞SMMC7721为研究对象进行处理，MT以不同浓度30、40、50、60（μM）,CuCl2以不同浓度15、20、25、30（μM）以及 MT和CuCl2以2:1比例的混合物分别作用于细胞24小时后：采用MTS法检测到上述混合物作用于细胞后能够明显抑制细胞增殖，抑制程度差不多相同。同等条件处理细胞24小时，Annexin V-FITC-PI双染后，采用荧光显微镜观察拍照，观察到上述混合物作用于细胞能够明显诱导细胞死亡，细胞死亡程度差不多相同。MT以不同浓度30、40、50、60（μM）,CuCl2以30（μM）以及MT和CuCl2混合后分别作用于细胞6小时后，检测细胞内酶活性，发现混合物抑制细胞内酶活性几乎一致均在60％左右。为了和人骨髓瘤细胞做出比较，调整药物浓度 MT以不同浓度30、60、90（μM），CuCl2以不同浓度15、30、45（μM）以及MT和CuCl2以2:1比例的混合物分别作用于细胞，采用Western blotting检测到细胞死亡的相关蛋白 PARP,发现上述混合物作用于细胞后能够引起明显的PARP的切割，并且存在浓度和时间依赖性。
　　以上结果得出药物铜-2-巯基苯并噻唑混合物可以诱导不同种肿瘤细胞死亡，但是对人肝癌细胞SMMC7721更为敏感一些。
　　(三)研究人骨髓瘤细胞NCI-H929和人肝癌细胞SMMC7721的死亡途径与其抑制细胞内蛋白酶体活性的关系
　　选用人骨髓瘤细胞NCI-H929和人肝癌细胞SMMC7721为研究对象进行处理，MT以不同浓度30、60、90（μM），CuCl2以不同浓度15、30、45（μM）以及MT和CuCl2以2:1比例的混合物分别作用于2种细胞6小时后，检测细胞内酶活性，发现混合物能够明显抑制细胞内酶活性，并且呈浓度依赖性。以相同的处理方法作用于NCI-H929细胞，采用Western blotting检测到反应UPS系统的内源性蛋白Ub,细胞死亡的相关蛋白PARP,以及Caspase家族相关蛋白，发现上述混合物作用于细胞NCI-H929后12小时能够引起明显的Ub聚集，并且成浓度依赖性，随着时间的增加，Ub逐渐降解。同时引起PARP的切割，并且存在浓度和时间依赖性。Caspase家族相关蛋白Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9前体减少，呈浓度依赖性。作用于细胞SMMC7721后12小时能够引起明显的Ub聚集，并且成浓度依赖性，随着时间的增加，Ub呈现稳定状态。同时引起PARP的切割，并且存在浓度和时间依赖性。Caspase家族相关蛋白Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9前体减少，Caspase-3，Caspase-9出现切割带，并且呈浓度-时间依赖性。
　　上述2种细胞蛋白酶体活性的抑制都出现在细胞死亡之前，因此得出铜-2-巯基苯并噻唑混合物通过抑制细胞内酶活性从而诱导细胞死亡，并且可能是和Caspase系统的活化有关。
　　（四）研究不同血清浓度影响药物对细胞的死亡诱导与其细胞内蛋白酶体活性的关系。
　　选用人肝癌细胞 SMMC-7721为研究对象进行处理，给予0%，1%，10%的不同血清浓度，MT以不同浓度30、60、90（μM），CuCl2以不同浓度15、30、45（μM）以及MT和CuCl2以2:1的比例作用于细胞，在不同时间点观察细胞，结果显示：随着血清浓度的降低，药物诱导细胞死亡存在时间和浓度依赖性。以相同的方法处理细胞6小时后，检测细胞内酶活性，发现药物抑制细胞内蛋白酶体活性并不明显。
　　结论：
　　1.铜-2-巯基苯并噻唑混合物引起内源性和外源性蛋白酶体底物蛋白的聚集。
　　2.铜-2-巯基苯并噻唑混合物能够诱导不同种肿瘤细胞死亡，但其敏感性不同。
　　3.铜-2-巯基苯并噻唑混合物通过抑制细胞内酶活性从而诱导细胞死亡，并且可能是和Caspase系统的活化有关。
　　4.不同血清浓度可以影响铜-2-巯基苯并噻唑混合物对细胞的死亡诱导作用，但是这种诱导作用与细胞内酶活性的抑制无关。

目录

封面

目录

中文摘要

英文摘要

前 言

材料与方法

一 细胞株

二 药品及主要试剂

1. 实验方法

1、细胞系的培养

2 、细胞传代

3、细胞的冻存

4、细胞的复苏

5、GFPu-HEK293稳定转染细胞系的建立

6观察指标及相对应的细胞处理

实验结果

讨论

结 论

参考文献

附图

中英文对照词表

综述

致谢

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