含卤肽核酸/改性壳聚糖纳米载药系统的设计及细胞摄取初步评价

摘要

肽核酸（peptide nucleic acid,PNA）是一种骨架结构由N-（2-氨基乙基）甘氨酸残基构成的人工寡核苷酸，具有与DNA/RNA杂交稳定性高、不被体内酶降解以及结构修饰灵活等优点，成为反义核酸领域的研究热点与前沿。作为第三代反义核酸药物，PNA在药学领域，尤其在抗肿瘤药物方面具有良好的应用潜力。然而，与大多数寡核苷酸类似，PNA存在跨细胞膜递送困难、细胞摄取率低的缺陷，严重阻碍了PNA的进一步开发与应用。为提高PNA的杂交性能和细胞转运性能，研究人员对PNA的骨架结构进行化学修饰，开发了种类众多的修饰型PNA。其中，在PNA骨架结构中引入卤素是一种典型的修饰方法，含卤原子PNA成为一类重要的修饰型PNA。近年来，为了提高PNA的细胞摄取性能，研究人员尝试了包括骨架结构改造、细胞穿透肽偶联以及纳米载体材料加载等方法，取得了一定的效果。然而，PNA细胞摄取率低的难题还未得到彻底解决，细胞转运缺陷依旧是阻碍PNA药物开发的难题之一，安全、高效的PNA传递策略仍然是PNA研究领域的重要内容。 两亲性壳聚糖衍生物具有良好的药物加载能力，并能在水相环境下自组装成纳米载药体系。而且，其表面的亲水基团可以抵抗体内巨噬细胞的吞噬，达到血液长循环效果；疏水基团可提高纳米粒的细胞摄取，载药纳米粒能以胞吞方式整体跨过细胞膜进入细胞内部。两亲性壳聚糖衍生物已经广泛应用于基因药物的加载与递送，但是，迄今还未有使用壳聚糖及其衍生物加载PNA的研究报道。因此，本研究将卤素成功引入PNA的同时，设计、合成两亲性壳聚糖衍生物；并以此为载体材料，加载PNA构建肽核酸-壳聚糖纳米载药系统，以期实现改善PNA细胞转运障碍的缺陷，提高PNA的细胞摄取率，为PNA药物的发现与开发提供理论参考。本文主要开展的研究内容如下： ①为提高传统PNA杂交性能，将功能性碱基5-卤代尿嘧啶（5-halouracils，5-XU）引入到PNA单体中。采用Fmoc氨基保护策略，设计和合成了系列5-XU-PNA新单体；同时，采用固相合成法设计和制备了系列嵌合有5-XU-PNA单体的PNA寡聚物。产物分别采用硅胶柱层析法和制备HPLC法纯化，获得了系列纯品，并采用MS、1H NMR、13C NMR和HPLC进行了结构鉴定。 ②为考察5-XU-PNA的碱基配对规律和杂交稳定性，采用紫外变温法研究了5-XU-PNA寡聚物与DNA/RNA的杂交行为。结果表明：含有一个单元5-XU-PNA的PNA七聚体与完全互补DNA或RNA杂交时，与不含卤素的PNA相比，其Tm值分别提高1.8-4.0℃、2.5-3.7℃，表明PNA链中嵌入5-XU-PNA单体能进一步提高其杂交稳定性。在PNA:DNA/RNA杂交体中，PNA中的5-XU碱基表现出与DNA/RNA中A碱基特异性配对的规律，而且，配对碱基的稳定性顺序为FU:A＞ClU∶A＞BrU∶A＞T/U∶A。 ③为考察5-XU-PNA中卤原子对杂交性能的影响机制，采用1H NMR法分析和评价了水溶液中5-XU-PNA:DNA杂交体。结果表明，与天然碱基T中N3亚氨基质子的化学位移相比，5-XUs中N3亚氨基质子的化学位移向低场移动0.62-0.76ppm，说明5-XUs中N3亚氨基质子的酸性比T中的强，5-XUs与A碱基配对时形成的氢键强度更大，杂交稳定性更好。5-XUs优异的杂交性能是由于C5上卤素原子的强吸电子效应降低了嘧啶环的电子密度，从而导致N3亚氨基质子酸性增强。 ④为满足构建含卤原子PNA纳米载药系统的需要，设计和合成了系列两亲性壳聚糖衍生物N,N,N-三甲基-O-烷基壳聚糖（N,N,N-trimethyl-O-alkyl chitosans,TMACs）。采用Williamson-Hall法对壳聚糖6位羟基进行O-醚化改造，引入不同长度的烷烃链，并作为疏水基团；将氨基进行季铵盐化改造，引入季铵阳离子，并作为亲水基团。产物采用透析法纯化，并采用FT-IR和1H NMR等方法对产物进行结构鉴定。 ⑤采用超声-透析法构建了PNA-TMAC纳米载药系统。形成的载药纳米粒粒径为100nm左右，表面Zeta电位为23.3-25.1mV。采用原子力显微镜检测，纳米粒呈规则球形，粒度均匀。TMAC中碳链长度和载药比对PNA的加载有显著影响，碳链长度为16时，载药效果最好，且最优载药比为20∶1。在该载药系统中，PNA的释放具有缓释效果，且符合一级释药方程，TMAC中碳链长度越长，缓释效果越好。 ⑥通过溶血反应和体外细胞毒性试验评价了载药纳米粒的安全性。结果表明，TMAC结构中引入的季铵阳离子给材料带来一定的安全风险，而O-醚化引入长碳链则对产物的溶血作用和细胞毒性有显著影响。TMAC系列衍生物的生物安全性能排序为TMCC＞TMDC＞TMBC＞TMOC，其中，碳链长度为16的TMCC在溶血反应和体外细胞毒性试验中都表现出优异的安全性能，其安全浓度范围为≤5mg/mL，是一种具有药学应用潜力的载药材料。 ⑦以HeLa细胞为模型，采用流式细胞术和激光共聚焦显微镜法考察了5-XU-PNA和PNA-TMCC纳米载药系统的细胞摄取效率。结果表明，与传统PNA类似，本研究制备的含5-XU-PNA单元结构的PNA链也具有细胞摄取困难的应用缺陷；然而，将PNA用TMCC加载后，所构建的纳米载药系统能高效地以细胞内吞方式跨过细胞膜，PNA的细胞摄取率提高了51-63倍。细胞粘附试验表明，PNA-TMCC载药纳米粒良好的跨细胞膜转运性能取决于该体系的合适粒径和表面高正电荷属性，该载药纳米粒能与带负电荷的细胞膜表面紧密结合，并以整体内吞方式进入胞内。 综上所述，本论文以改善PNA的跨细胞膜递送为出发点，聚焦于构建5-XU-PNA-TMAC纳米递药系统。一方面，设计和合成了系列含功能性碱基5-XU的PNA新单体，并将该单体嵌入到PNA寡聚物中，所制备的PNA寡聚物与DNA/RNA杂交时表现出优异杂交稳定性。另一方面，对壳聚糖进行两亲性结构改造，分别引入长烷基和季铵阳离子作为疏水和亲水基团，设计和合成了系列两亲性壳聚糖衍生物TMAC。溶血试验和体外毒性试验表明，TMCC载体材料生物毒性低，安全性能好。在此基础上，构建PNA-TMAC纳米载药体系，结果表明TMAC系列材料具有良好的加载PNA能力，所形成的载药纳米粒中PNA的释放具有缓释效果。而且，流式细胞术和激光共聚焦显微镜法测试表明所构建的纳米载药体系PNA-TMCC显著地改善了PNA细胞摄取困难的缺陷。

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