青枯无致病力菌株对烟草青枯病的室内控病研究

摘要

烟草青枯病是由劳尔氏菌属的茄假单胞杆菌Ralstonia solanacearum引起的一种系统性侵染病害，对烟草的产量和质量影响极大，是烟草上一大毁灭性病害，其防治十分困难。生物防治对烟叶生产的可持续发展具有较好的应用前景。利用青枯无致病力菌株作为生防菌，它们能够在与病原菌相似的生态条件下发挥作用，且对生态环境的影响很小。本研究从重庆不同区县采集茄、番茄、烟草和辣椒青桔病株分离青桔无致病力菌株，并通过紫外光诱变和连续转代青枯致病菌获取无致病力菌株。对这些菌株进行平板拮抗筛选及温室控病试验，并对它们诱导烟草植株体内防御酶系活性及病程相关蛋白变化进行了测定。 1.从2006年6月初至9月底，在重庆市璧山县、北碚区、九龙坡区白市驿镇、江津区、酉阳县和涪陵区采集青枯病株样本共184份，其中茄青枯病株67份，番茄青枯病株42份，烟草青枯病株38份，辣椒青桔病株37份。分离纯化保存并初步鉴定菌株共138株，其中青枯致病菌株22株，占获得的青枯菌株总数的16％。22株青枯致病菌株中，茄青枯菌13株，烟草青枯菌6株，番茄青枯菌2株，辣椒青枯菌1株。无致病力菌株116株，占获得的青枯菌株总数的84％，其中番茄青枯菌41株，茄青枯菌41株，辣椒青枯菌21株，烟草青枯菌13株。 2.将直接分离得到的青枯无致病力菌株116株，通过紫外光诱变得到的青枯无致病力菌株42株，及连续转代获得的青枯无致病力菌株19株，对它们进行烟草青枯菌的平板抑菌试验。初筛得到对烟草青枯菌有抑菌活性的菌株共62株，其中61株为直接分离得到的菌株，1株为紫外光诱变得到。进行复筛后得到抑菌带宽≥1 cm的菌株21株；抑菌带宽为0.5～1 cm的菌株13株；抑菌带宽度≤O.5 cm的菌株28株。将抑菌带宽≥1 cm的菌株采用喷雾法和含菌培养基法两种筛选方法比较。结果表明：采用喷雾法得到的抑菌带宽普遍大于含菌培养基法得到的，只有Tmt3-2-1和TbYYk1-1两个菌株是例外。通过两种方法比较，认为喷雾法比含菌培养基法操作简便、快捷，比较适用于平板筛选试验。 3.平板筛选出的抑菌带宽≥1 cm的21株菌株，对它们进行烟草青枯病的温室控病试验。初测结果表明：这21株菌株大部分能够使烟草推迟7 d发病，CKB只灌接待测菌株的烟草苗未表现明显异常，初步说明它们对烟草是安全的。在接种20 d后，相对防效＜70％有6株，其余的相对防效＞70％。结合菌株在NA培养基上的生长势，将其中的6株进行复测。结果表明：L6-3、Tmjdl-3、Au004-1、TbYYk1-1和Aujd8-2-1处理分别较CKRs推迟发病14 d、6 d、5 d、2 d和1 d。L6-3、Au004-1和Tmjd1-3处理对烟草青桔瘸的温室控瘸效果较好。在接种30 d后，它们的相对防效分别达到80.83％、77.5％和75％，其中L6-3处理的相对防效最好。 4.在NA培养基上的生长势较好且温室控病效果较好的青枯无致病力菌株Au004-1和Tmjdl-3，用它们分别处理烟草后测定植株体内的苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)及多酚氧化酶(PPO)活性，并通过电泳分析烟草植株体内病程相关蛋白(PRP)的变化。结果表明：它们处理烟草后，植株体内的PAL、POD及PPO活性增强，PRP含量也有提高。表明青桔无致病力菌株对烟草青枯瘸的控病机制除了对致病菌的直接抑制作用外，很可能诱导烟草植株产生了抗病性。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1植物细菌性青枯病研究概况

1.1青枯病的发生特点

1.2青枯病的病原学研究

1.3寄主范围

1.4青桔菌致病机理研究

2植物细菌性青枯病生物防治途径的研究概况

2.1无致病力青枯菌的利用

2.2其他有益微生物的应用

2.3其他生物防治途径

3植物细菌性青枯病生物防治的机制

3.1抗菌作用

3.2位点竞争作用

3.3诱导抗病性

3.4其他生防机制

第二章引言

第三章材料与方法

1供试材料

1.1病害标样

1.2供试菌株

1.3烟草品种

1.4培养基

1.5主要仪器

1.6主要试剂和常用储备液及缓冲液

2试验方法

2.1培育供试苗

2.2青枯菌的分离

2.3青枯致病菌的致病性测定

2.4青桔菌致病菌的紫外诱变

2.5青枯菌致病菌的转代

3无致病力菌株的初步鉴定

3.1载玻片和待测菌株的准备

3.2染色方法

4青枯无致病力菌株的平板拮抗筛选

4.1初筛

4.2复筛

5温室盆栽控病试验

5.1温室盆栽控病试验初测

5.2温室盆栽控病试验复测

6青枯菌无致病力菌株诱导烟草抗病性的作用

6.1接种处理

6.2酶活性测定

6.3病程相关蛋白的提取及电泳

第四章结果与分析

1样本采集及分离情况

2无致病力菌株的初步鉴定结果

3青枯无致病力菌株平板筛选

3.1初筛结果

3.2复筛结果

4青枯无致病力菌株的温室盆栽控病试验

4.1初测结果

4.2复测结果

5青枯无致病力菌株诱导烟草产生抗病性的生理生化变化

5.1苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性变化

5.2过氧化物酶(POD)的活性变化

5.3多酚氧化酶(PPO)的活性变化

5.4病程相关蛋白的提取及电泳

第五章结论与讨论

1青枯无致病力菌株的采集与分离

2青枯无致病力菌株的平板筛选

3青枯无致病力菌株的温室控病

4青枯无致病力菌株诱导烟草产生抗病性的生理生化变化

5试验中的不足及展望

5.1青枯无致病力菌株的分离及鉴定

5.2青枯无致病力菌株的温室控病试验

5.3青枯无致病力菌株诱导烟草产生抗病性的生理生化变化

结语

参考文献

附图

致谢

硕士期间发表的论文