芥菜种质资源遗传多样性的RAPD和ISSR分析

摘要

芥菜(Brassica juncea Czem．et Coss)是我国原产的一类蔬菜作物。近一个世纪以来，人们对芥菜的分类进行了长期研究，但观点不一，存在较大的争议。本研究借助RAPD标记和ISSR标记对28份芥菜材料的遗传多样性以及亲缘关系进行了分析和评价。实验结果表明，本次实验所采用的两种分子标记对28份芥菜材料检测出了不同的多态性水平。主要结果如下： 1．建立了适于芥菜基因组DNA提取的方法：采用幼叶作为试验材料，采用改良CTAB法，即在液氮研磨过程中加入PVP粉末，以防止酚类物质氧化，获得了高质量的芥菜基因组DNA。 2．优化并建立了芥菜RAPD和ISSR反应体系。20μL RAPD反应体系中，模板DNA40ng，引物10pmol/μL，10×反应缓冲液，dNTPs为0.3mmol/L，TaqDNA聚合酶1U，Mg2+2.0mmol/L，并进一步进行梯度退火实验，找剑了芥菜RAPD最适的退火温度为38℃。20μL ISSR反应体系中，模板DNA40ng，引物10pmol/μL，10×反应缓冲液，dNTPs为0.5mmol/L，TaqDNA聚合酶1U，Mg2+2.0mmol/L，找到了芥菜ISSR最适的退火温度为51℃。 3．从300条RAPD引物中筛选出20条引物分别对28份芥菜基因组DNA进行PCR扩增，共扩增山162条清晰的谱带，其中140条显示多态性，平均每个引物扩增出7.0条多态性谱带。从50条ISSR引物中筛选出18条引物分别对28份芥菜基因组DNA进行PCR扩增，共扩增出143条清晰的谱带，其中124条显示多态性，平均每个引物扩增出6.9条多态性谱带。 4．基于RAPD数据估计芥菜种质材料的遗传相似系数(GS)结果，28份材料之间的GS值在0.55～0.96之间，平均为0.72，由供试材料RAPD分子标记数据的相似系数聚类分析所绘出的树状聚类，当GS=0.72～0.76时，可将28份芥菜种质划分为三大类。基于ISSR数据估计芥菜种质材料的遗传相似系数(GS)结果，28份材料之间的GS值在0.57～0.96之间，平均为0.74，由供试材料ISSR分子标记数据的相似系数聚类分析所绘出的树状聚类图，当GS=0.72～0.76时，可将28份芥菜种质划分为三大类。 5．基于RAPD和ISSR混合数据估计芥菜种质的遗传相似系数(GS)结果，28份芥菜材料之间的相似系数值在0.58～0.97之间，平均为0.76，由供试材料的RAPD和ISSR两种实验方法的数据混合后的相似系数聚类分析所绘出的树状聚类图，当GS=0.72～0.64时，可将28份芥菜种质划分为三大类。这与RAPD和ISSR分析的结果甚为相似，但比较而言，与ISSR分析的结果更为相近。 本实验表明，不同的分子标记对相同的作物群体揭示出的遗传多样性水平和变异水平有差异。但是无论RAPD标记还是ISSR标记结果都揭示出芥菜有较高的变异水平和丰富的多样性。我们得出以下结论：(1)芥菜的遗传多样性水平和变异水平很高。(2)RAPD和ISSR分子标记技术在亲缘关系较接近的芥菜材料间的遗传多样性评价中十分有效。不同的分子标记对相同遗传群体的遗传变异和多样性水平的分子检测能力不同。并且，将不同的分子标记的基础数据合并，通过联合数据去建立亲缘关系系统树，可能会比单个分子标记对群体的遗传多样性以及亲缘关系的评价更具有客观性。

目录

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论文说明：缩略词

声明

第1章文献综述

1.1遗传多样性的概念、研究方法及意义

1.1.1概念

1.1.2遗传多样性的研究方法

1.1.3遗传多样性研究意义

1.2分子标记种类及其在植物育种中的应用

1.2.1分子标记种类及特点

1.2.2 DNA分子标记在植物育种中的应用

1.3分子标记技术在芥菜种质资源研究上的应用与发展

1.3.1芥菜的起源

1.3.2芥菜的分布

1.3.3芥菜的分类研究现状

1.4本研究的目的和意义

第2章引言

第3章材料与方法

3.1材料

3.1.1供试材料

3.1.2主要试剂与配置

3.1.3主要仪器设备

3.2方法

3.2.1实验设计

3.2.2芥菜基因组DNA的提取与质量检测

3.2.3芥菜RAPD实验程序

3.2.4芥菜ISSR实验程序

3.2.5数据统计与分析方法

第4章结果与分析

4.1基因组DNA提取与质量检测结果

4.1.1紫外检测

4.1.2电泳检测

4.2芥菜种质的RAPD分析

4.2.1 RAPD反应体系的建立

4.2.2退火温度的确定

4.2.3 RAPD引物筛选

4.2.4遗传多样性分析

4.3芥菜种质的ISSR分析

4.3.1 ISSR反应体系的建立

4.3.2退火温度的确定

4.3.3 ISSR引物筛选

4.3.4遗传多样性分析

4.4芥菜RAPD和ISSR实验数据混合后的综合聚类分析

第5章讨论

5.1芥菜DNA的提取质量

5.2技术体系的建立

5.2.1分子标记技术反应稳定性及影响因素

5.2.2正交设计在PCR反应体系优化上的运用

5.3遗传多样性

5.4两种分子标记分析比较

5.5芥菜的遗传多样性评价

第6章结论

6.1高质量芥菜DNA的提取和纯化技术

6.2优化并建立了芥菜RAPD和ISSR的反应体系

6.3获得了28份芥菜种质的RAPD和ISSR标记的特异性扩增带

6.4 RAPD和ISSR标记聚类结果

6.5 RAPD和ISSR两种标记的一致性

6.6基于RAPD和ISSR标记混合数据聚类结果

参考文献

致谢

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附录