小鼠人工杂合四倍体孤雌胚胎生成途径及其体外发育效果观察

摘要

小鼠体外发育胚胎无论是体外受精胚、体细胞克隆胚或者是孤雌激活发育的胚均存在比较明显的2-细胞阻滞现象。早期胚胎发育过程中不同动物在不同时期所表现出来的这种发育阻滞现象正好位于母体—胚胎核基因支撑其发育的过渡期，被认为是胚眙基因组核基因重新程序化和基因活化启动转录及表达促细胞生长因子异常所致。不同倍性染色体核型的孤雌胚胎表现二细胞发育阻滞现象尤为明显，据报道[1]单倍体、纯合二倍体和杂合二倍体孤雌胚胎发育至4细胞胚胎的比率分别是18.5％、23.7％和35.3％。说明早期胚胎卵裂球单细胞核内染色体数目愈多、染色质杂合性愈大，支撑小鼠孤雌胚胎过阻滞期发育的能力就愈强。 已知小鼠孤雌胚胎染色质倍性和同质异质性与激活小鼠卵母细胞的方法有很大关系。为此，本实验通过人工选择不同的小鼠成熟卵母细胞激活方式，探索获取高比率杂合二倍体孤雌胚胎的有效途径，再通过选择能够使二细胞胚胎发生有效融合的适宜电融合条件，在本实验室建立体外电融合双卵裂球杂合二倍体孤雌胚胎，人工生成四倍体孤雌胚胎的方法，体外培养这种四倍体孤雌胚胎，旨在研究小鼠早期孤雌胚胎卵裂球单个细胞染色质物质在质量加倍、性质异质化的基础上观察克服2-细胞阻滞现象、提高囊胚生成效率的情况，为进一步研究胚胎早期发育初始机制、提高体细胞核移植的成功比率和孤雌囊胚生成效率奠定基础。试验结果如下： 试验一：获取高比率杂合二倍体孤雌胚胎的孤雌激活方式研究。试验通过不同化学激活剂对小鼠成熟卵母细胞进行孤雌激活，显微操作仪下观察第二极体是否排出并结合核型分析，旨在研究不同激活方式所得到的激活卵的染色质倍性，并对不同染色质倍性的激活卵体外培养发育至囊胚，比较其发育率，选择生成二倍体孤雌胚胎效率最佳的孤雌激活方法制作小鼠人工杂合四倍体孤雌胚胎。结果显示：(1)7％乙醇激活7min，主要形成单倍体激活卵，激活率和囊胚发育率分别为94.28％和30.00％；(2)10 mmol/L的SrCl2激活6h，多排出第二极体形成单倍体激活卵，激活率和囊胚发育率分别为70.34％和27.97％；(3)7％乙醇激活5min后移入2 mmol/L6—DMAP+5μg/mL CB的CZB中激活3h及5μg/mLA23187+2mmol/L6—DMAP+CB作用3h均能有效激活小鼠卵母细胞，激活后抑制第二极体排出而出现2个原核杂合二倍体的比率较高，其激活率、囊胚发育率分别为97.73％、38.64％vs94.70％、36.92％。结果表明：7％乙醇联合2mmol/I6—DMAP+5μg/mL，CB作用3h的激活方式能有效抑制第二极体排出，获得较多杂合二倍体孤雌胚胎，与单倍体孤雌胚胎相比，其孤雌囊胚发育率明显提高。 试验二：昆白小鼠2-细胞胚胎卵裂球电融合制作四倍体胚胎的最适宜电融合条件探索。本试验将见栓雌鼠21～24h后处死，取2-细胞胚胎，置于电融合液中，设计四组电融合参数(A组：脉冲电压为600V/cm、脉冲宽度为50μs、间隔1s；B组为1200V/cm、30μ、间隔1s；C组为600 V/cm、10μs、间隔1s；D组为1200V/cm、50μs、间隔1s)对昆白小鼠2-细胞胚胎进行融合，融合后转入mM16培养液中，37℃，5％CO2培养，72 h后检查囊胚率，旨在探索胚胎电融合后获得较高囊胚发育率的最适宜电融合参数，为下一步体外电融合双卵裂球杂合二倍体孤雌胚人工生成四倍体孤雌胚胎建立最适宜的电融合条件。试验结果：A组和B组融合率最高，分别可达到68.18％、66.30％，差异不显著(P＞0.05)；而C组和D组的融合率显著低于其他两组，融合率分别为47.57％、49.47％； A组和B组电融合后囊胚发育率分别为45.45％、44.57％，两者差异不显著(P＞0.05)。以上结果表明：脉冲电压为600V/cm、脉冲宽度为50μs、间隔1s为2-细胞胚胎电融合形成四倍体胚胎的最适宜电融合条件。 试验三：小鼠人工杂合四倍体孤雌胚胎的制作及其与杂合二倍体孤雌胚胎体外发育情况的比较。本试验采用试验一的最佳激活方法获得杂合二倍体孤雌胚，再采用试验二得出的最佳电融合参数将获得的杂合二倍体2-细胞胚体外电融合人工生成四倍体孤雌胚胎，体外培养使其发育至囊胚，与杂合二倍体孤雌胚比较其囊胚发育率，旨在研究小鼠早期孤雌胚胎卵裂球单个细胞染色质物质在质量加倍、性质异质化的基础上观察克服2-细胞阻滞现象、提高囊胚生成效率的情况，为进一步研究胚胎早期发育初始机制、提高体细胞核移植的成功比率和孤雌囊胚生成效率奠定基础。试验结果：(1)卵母细胞采用7％乙醇联合2mmol/I6—DMAP+5μg/mL CB的激活方式，激活后培养24h选取79枚杂合二倍体2-细胞胚胎微滴培养，有30枚发育至囊胚，其囊胚发育率为37.9％(30/79)；(2)采用同样的激活方式，选取同样数目的79枚杂合二倍体2-细胞胚胎，采用600V/cm、50μs、间隔1s的电融合条件对2-细胞胚胎体外融合生成杂合四倍体胚胎，融合胚胎数为58，在mM16培养基中经过72h体外培养最后有44枚发育至囊胚，其囊胚形成率为55.7％(30/79)。 结论：昆白小鼠经过超排处理在注射HCG16h收集排出第一极体的成熟卵母细胞，采用7％乙醇联合2mmol/I6—DMAP+5μg/mL CB作用3h的人工激活方式进行激活，激活卵在mM16培养基中培养24h后获得杂合二倍体2-细胞胚胎，采用600V/cm的脉冲电压、50μs的脉冲宽度、间隔1s对这种胚胎在体外电融合人工生成四倍体孤雌胚胎，在mM16培养基中经过72h体外培养使其发育至囊胚，这种人工制作的四倍体孤雌胚胎的囊胚发育率显著高于二倍体孤雌胚的囊胚发育率(55.7％vs37.9％，P＜0.05)。说明小鼠早期孤雌胚胎卵裂球单个细胞染色质物质在质量加倍、性质异质化的基础上能够有效克服2-细胞阻滞现象、提高囊胚生成效率。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一部分 文献综述

第一章卵母细胞孤雌激活研究进展

1小鼠卵母细胞孤雌激活与孤雌胚发育

2卵母细胞孤雌激活的方法

3孤雌胚的核型

4孤雌胚的发育

第二章细胞电融合技术国内外研究进展

1细胞电融合技术国内外研究动态

2电融合技术的机制

3电融合技术在生成小鼠人工杂合四倍体孤雌胚胎中的应用

4研究孤雌胚发育及融合发育的意义

第二部分 实验研究

前言

1材料与器具

1.1实验动物

1.2主要试剂及药品

1.3主要仪器设备

1.4主要溶液制备方法

1.5捡卵针的制备

2.试验方法与试验设计

2.1获取高比率杂合二倍体孤雌胚胎的孤雌激活方式研究

2.2小鼠2-细胞胚胎电融合制作四倍体胚胎的电融合适宜条件探索

2.3小鼠人工杂合四倍体孤雌胚胎的制作及其与杂合二倍体孤雌胚体外发育情况的比较

2.4数据统计

3.结果与分析

3.1不同激活方式对小鼠激活卵形成及孤雌胚发育的比较

3.2小鼠2-细胞胚胎电融合制作四倍体胚胎的电融合适宜条件探索

3.3小鼠人工杂合四倍体孤雌胚与杂合二倍体孤雌胚胎体外发育情况的比较

4.讨论

4.1卵母细胞激活机制

4.2不同激活方法对孤雌胚形成及发育的影响

4.3不同融合条件对卵裂球融合的影响

4.4小鼠人工杂合四倍体胚胎制作的影响因素

5.结论

参考文献

附录1：缩略词表(Abbreviations)

附录2试验图片

致谢

附录3发表论文：