犬细小病毒环介导等温扩增方法的建立和VP2基因的克隆表达

摘要

犬细小病毒病是由犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)引起犬的高度接触性烈性传染病。本病在世界各地均有发生,各种年龄、品种的犬易感,尤其是断奶后幼犬的发病率和死亡率均很高。本病临床上以剧烈的呕吐、出血性肠炎和白细胞显著减少为特征,为犬危害性最大的疾病之一。因此,该病的早期快速诊断对于疾病的控制至关重要。
　　 目前,CPV的检测方法主要以血清学和分子生物学检测方法为主,随着分子生物学技术的不断发展和成熟,作为新生的分子生物学检测方法,环介导等温扩增技术(Loop-mediatedIsothermal Amplification.LAMP)应运而生,成为早期快速诊断犬细小病毒的有力手段。
　　 本试验从GenBank中获得CPVVP2基因序列,应用MegAlign软件分析其序列,利用PrimerExplorer V3软件在序列保守区域设计内、外和环三对引物,同时还对CPV VP2基因进行PCR扩增,克隆至T载体,构建了阳性质粒,并利用克隆的阳性质粒为模板,对LAMP试验中的几个重要参数进行了优化。试验结果表明所建立的LAMP检测方法灵敏度达到2～3个拷贝,表现出良好的特异性,对其它细小病毒无特异性扩增。与PCR技术相比,LAMP法操作更加简单方便,整个过程在水浴锅中即可完成,而且肉眼可直接观察试验结果。在临床试验中,样品检测阳性率达到100％。该方法是适合基层和现场检测的快速灵敏实用的分子生物学检测方法。
　　 CPV VP2蛋白是主要的结构蛋白,能诱导动物产生中和抗体,是病毒重要的保护性抗原。在本试验中将上步试验构建的CPV-YM株VP2基因阳性克隆连接到pET-32a原核表达载体中,纯化后获得了VP2重组蛋白,为接下来研究CPV血清学检测方法提供了基础。
　　 本试验将CPV-YM株VP2基因亚克隆到表达载体pET-32a上,获得表达重组子pET-32a-VP2,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定后,序列分析确定该重组子YM株VP2基因ORF正确,转化E.coli Rosetta(DE3),获得了基因工程菌株E.coli Rosetta(CVP2)。经优化的诱导条件是,终浓度为1 mM的IPTG经30℃培养5 h,E.coli Rosetta(CVP2)菌体经超声波处理后的裂解物,离心沉淀,经4 M尿素洗涤沉淀后再经8尿素变性以及镍琼脂糖凝胶色谱纯化,SDS-PAGE检测纯化样品中含有87 kDa目的蛋白,Western blot检测发现该蛋白与犬细小病毒多克隆抗体发生反应,出现特异条带。试验结果表明,E.coli Rosetta(CVP2)以包涵体形式表达出了CPV-YM株VP2,从而为进一步制备检测抗体效价的胶体金检测试剂盒的开发研究打下了良好的基础。