类球红细菌群体感应系统与PHB积累、产氢关系研究

摘要

细菌的群体感应现象转变了人们长期以来认为细菌是自由生活的单细胞生物这种看法。群体感应(quorum-sensing,简称QS)即细菌通过产生一种自体诱导物(Autoinducer,AI)的信号分子感应细胞密度变化从而进行基因表达调控的一种生理行为。在英语中Quorum原意为“法定人数”，在这里被巧妙地用来指一定的细菌密度。
　　 不同的群体感应系统响应不同的信号分子来调控基因的表达，显示出多细胞生物的行为。革兰氏阴性细菌的信号分子大多是酰基高丝氨酸内酯衍生物AI-1；革兰氏阳性细菌的信号分子通常是寡肽类；还有一类信号分子是一种新的呋喃酰硼酸二脂AI-2，被认为可能是“通用”信号分子(universal signal)。
　　 革兰氏阴性菌的类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)是光合细菌的主要成员之一，能在光照厌氧条件下产氢，产生7,8-cis-N-(tetradecenoyl)homoserine lactone信号分子，被称为cer群体感应系统。研究类球红细菌的QS系统对细菌产氢行为的影响，不仅有利于解读细菌的整体调控网络，也有利于理解类球红细菌能源的利用模式和调控，对未来生物质能的生产也有重要的指导意义。
　　 研究了不同的外部条件对类球红细菌生长的影响，初步确定了细菌产氢的最优化条件，并通过染色，观察到了菌体的PHB(聚-β-羟基丁酸酯)。研究结果发现，该菌在pH值7.0～8.0、光照强度2000 lx左右、温度30℃～35℃的范围内均能较好的生长。厌氧光照是细菌生长的最佳模式。在5000～9000 lx光照强度，30℃～35℃范围内产氢较适宜。琥珀酸钠、丙酮酸钠和葡萄糖都是类球红细菌生长和产氢的良好碳源和氢供体。
　　 研究了一种既简洁又经济的检测PHB含量以及PHB合酶活性的方法。体外检测PHB合酶的活性的最佳反应体系是：温度在30～45℃之间；盐浓度为25％(w/v)NaCl，0.2％(w/v)KCl，0.5％(w/v)MgSO4·7H2O；最适pH值应该是7.0。可以通过提取类球红细菌各个生长阶段菌液的PHB颗粒，然后加入底物(Hydroxybutanoyl-CoA)、离子浓度以及DTNB，在最适温度与pH值条件下反应后读取412 nm处吸光度值(A)，通过巯基(-SH)浓度标准曲线计算出PHB合酶活性。
　　 成功使用了比色法和检测菌株两种方法对类球红细菌的信号分子进行了检测。比色法发现信号分子在520nm处的吸光值与信号分子的浓度具有很好的线性关系，但由于类球红细菌所产生的信号分子没有标准物，此法只能检测信号分子的存在及相对浓度。
　　 类球红细菌的信号分子可以促进对数期细菌的趋散生长，而对于稳定末期的细菌效果不明显。同属细菌的上清液做为培养液进行添加时，细菌的生长受到抑制。用信号分子处理后的细菌可以明显改变菌体的碳源代谢，推测是菌体优先利用信号分子做为能源物质的结果。
　　 在产氢反应器中研究类球红细菌群体感应与产氢的关系。添加不同浓度的信号分子做为诱导物，通过检测PHB含量、PHB合酶的活性以及产氢量综合分析群体感应与产氢的关系。研究发现：信号分子在类球红细菌产氢过程中，可以通过抑制对数期PHB合酶的活性从而抑制PHB的形成，使得更多的还原力用于产氢；群体感应可以通过调控脂烯酰基酰基载体蛋白还原酶的活性而调控PHB合酶的活性；在细菌生长末期中，信号分子可以调节自身的代谢，通过利用PHB分解产生的能量维持细菌存活。

目录

文摘

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声明

第1章文献综述

1.1细菌群体感应及其研究进展

1.1.1细菌群体感应系统的调节机制

1.1.2细菌群体感应系统的信号分子

1.1.3群体感应系统调控的生物功能

1.2类球红细菌群体感应及其与产氢的关系

1.3研究群体感应的方法

1.4课题的提出及研究内容

1.4.1课题的提出

1.4.2研究内容

第2章类球红细菌基本特性研究

2.1材料与方法

2.1.1菌株来源与培养基

2.1.2生长曲线的测定

2.1.3正交试验设计

2.1.4检测方法

2.1.5菌体染色

2.1.6产氢条件优化研究

2.2结果与讨论

2.2.1生长曲线的绘制

2.2.2正交试验结果

2.2.3染色结果

2.2.4碳源、光照、温度、交替光照对产氢的影响

2.3本章小结

第3章类球红细菌中PHB含量及PHB合酶活性检测

3.1材料与方法

3.1.1菌株来源与培养基

3.1.2测定及分析方法

3.2结果与讨论

3.2.1 PHB浓度标准曲线的绘制

3.2.2 PHB合酶测定原理

3.2.3巯基标准曲线的绘制

3.2.4 PHB合酶酶学特性分析

3.2.5 PHB合酶活性检测的最佳反应体系的确立

3.3本章小结

第4章信号分子的检测及其对菌落形态、碳源利用的影响

4.1材料与方法

4.1.1菌株来源与培养基

4.1.2培养条件

4.1.3信号分子的浓缩抽提

4.1.4信号分子检测

4.1.5平板法设计

4.1.6 Biolog碳源代谢分析

4.2结果与讨论

4.2.1比色法检测信号分子

4.2.2检测菌株JZA1检测信号分子

4.2.3加入信号分子的平板培养

4.2.4碳源代谢多样性分析

4.3本章小结

第5章类球红细菌群体感应、PHB与产氢关系研究

5.1材料与方法

5.1.1菌株来源与培养基

5.1.2信号分子的浓缩抽提

5.1.3 PHB含量的测定

5.1.4 PHB合酶活性的测定

5.1.5产氢装置和氢气含量的测定

5.1.6信号分子加入不同生长阶段的类球红细菌

5.2结果与讨论

5.3本章小结

第6章结论与展望

6.1结论

6.2本文创新之处

6.3展望

参考文献

致 谢

在读期间参加的科研课题和发表的相关论文