柑橘全爪螨抗药性监测及其细胞色素P450基因的克隆

摘要

柑橘全爪螨Panonychus citri(McGregor)是一种对柑橘危害严重的世界性害螨。该螨的抗药性问题已引起全世界范围内的科学工作者及管理部门的高度重视。本学位论文采用玻片浸渍法测定了柑橘全爪螨田间种群对常用杀螨剂的敏感性，比较研究了取食不同柑橘种质资源的柑橘全爪螨对杀螨剂的敏感性差异，同时测定了磷酸三苯酯(TPP)、顺丁烯二酸二乙酯(DEM)和增效醚(PBO)3种增效剂对杀螨剂的增效作用，研究的目的旨在掌握柑橘全爪螨对杀螨剂的抗药性水平及其抗药性形成的生理生化机制，为柑橘全爪螨的抗药性治理提供依据。此外，利用RT-PCR和RACE技术克隆获得了柑橘全爪螨细胞色素P450基因cDNA全长和片段各1条，为进一步研究P450基因介导柑橘全爪螨抗药性的分子机制提供了基础数据。主要研究结果如下：
　　 ㈠柑橘全爪螨田间种群对常用杀螨剂的敏感性监测：⑴柑橘全爪螨对4种杀螨剂的敏感性监测。2008-2009年两年敏感性监测结果显示，柑橘全爪螨对供试的4种杀螨剂中的甲氰菊酯(菊酯类农药)敏感性下降最快，LC50值在两年间分别为4.93 mg·L-1和25.17 mg·L-1，相对抗性达5.1倍；其次是哒螨酮(杂环类农药)，LC50值分别为3.78 mg·L-1和8.38 mg·L-1，相对抗性达2.2倍；柑橘全爪螨对阿维菌素(生物源类农药)的敏感性基本维持不变；而对甲维盐(半合成抗生素类农药)的敏感性却有所上升，2009年柑橘全爪螨对甲维盐的相对敏感性是2008年的1.4倍。⑵取食不同柑橘种质资源的柑橘全爪螨对常用杀螨剂的敏感性测定。采自不同柑橘种质资源上的柑橘全爪螨对甲氰菊酯和哒螨酮均存在一定的敏感性差异。柑橘全爪螨不同食物种群对甲氰菊酯的敏感性由高到低依次为柚、橘和枳壳，其中枳壳种群对甲氰菊酯的相对抗性是柚种群的2.34倍；对哒螨酮的敏感性由高到低依次为柚、枳壳和橘种群，其中橘种群对哒螨酮的相对抗性是柚种群的3.92倍；而取食柑橘不同种质资源的柑橘全爪螨对阿维菌素的敏感性并无显著差异。
　　 ㈡三种增效剂对常用杀螨剂的增效作用。增效剂增效作用测定结果表明，TPP对甲氰菊酯、阿维菌素和甲维盐有显著的增效作用，增效倍数分别为3.2倍、2.0倍和3.8倍。DEM对哒螨酮和甲维盐具有显著的增效作用，增效倍数分别为3.3倍和2.6倍。PBO对甲氰菊酯、哒螨酮和甲维盐有显著的增效作用，增效倍数分别为2.7倍、2.4倍和7.2倍。PBO对阿维菌素有一定的增效效果，其增效倍数为1.7倍。而TPP对哒螨酮以及DEM对甲氰菊酯和阿维菌素均无增效作用。
　　 ㈢柑橘全爪螨细胞色素P450基因的克隆。利用RT-PCR，克隆获得了2条柑橘全爪螨P450基因片段N1和N2，GenBank登录号分别为FJ480403和FJ480404。通过RACE技术，克隆得到了N2的全长序列，该全长基因被命名为CYP4CF1，其序列全长1880 bp，包括1527 bp编码508个氨基酸的开放阅读框，87 bp的5'端非编码区长，286 bp的3'端非编码区，起始密码子ATG，终止密码子TAA。在其核酸序列3'末端发现有典型加尾信号(ATTAAA)的poly-A结构。其推导氨基酸包含P450基因经典的血红素结合位点的共有序列F××G×××C×G、位于螺旋K中参与稳定核心结构的完全保守序列E××R以及CYP4家族的特征序列EVDTFMFEGHDTT。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1害虫(螨)抗药性概况

1.1害虫(螨)的抗药性问题

1.2害虫(螨)抗药性产生的原因

1.3害螨抗药性的特殊性

2柑橘全爪螨抗药性的研究

2.1抗药性监测方法

2.2抗药性监测

2.3抗药性机制

2.4不同寄主植物对抗药性的影响

3细胞色素P450在抗药性中的地位和作用

3.1细胞色素P450的保守结构和功能

3.2细胞色素P450与害虫(螨)抗药性的关系

前言

第二章柑橘全爪螨田间种群对常用杀螨剂的敏感性监测

1材料与方法

1.1供试螨源

1.2供试药剂与仪器

1.3生物测定方法

1.4数据处理

2结果与分析

2.1柑橘全爪螨田间种群对常用杀螨剂的敏感性监测

2.2取食不同种质资源柑橘全爪螨对杀螨剂的敏感性差异比较

3讨论

第三章三种增效剂对常用杀螨剂的增效研究

1材料与方法

1.1供试螨源

1.2供试药剂与仪器

1.3生物测定方法

1.4增效测定方法

1.5数据处理

2结果与分析

3讨论

第四章柑橘全爪螨P450基因的克隆

1材料与方法

1.1供试螨源

1.2主要试剂(盒)与仪器

1.3柑橘全爪螨总RNA的提取

1.4柑橘全爪螨P450基因片段的扩增

1.5柑橘全爪螨P450基因全长的扩增

1.6 PCR产物的克隆及测序

1.7序列分析

2结果与分析

2.1柑橘全爪螨总RNA的提取

2.2柑橘全爪螨P450基因cDNA片段的扩增

2.3柑橘全爪螨P450基因cDNA 3’末端和5’末端的快速扩增

2.4柑橘全爪螨P450基因cDNA全长的验证

2.5柑橘全爪螨P450基因cDNA序列的生物信息学分析

2.6柑橘全爪螨CYP4CF1基因编码蛋白质三维结构的同源建模

2.7系统发育分析

3讨论

第五章主要结论与展望

1主要结论

1.1明确了重庆北碚柑橘全爪螨田间种群对常用杀螨剂的敏感性

1.2分析了取食不同种质资源柑橘全爪螨对常用杀螨剂的敏感性差异

1.3探明了三种增效剂对4种常用杀螨剂的增效作用

1.4克隆获得了柑橘全爪螨P450基因CYP4CF1的cDNA全序列

2展望

参考文献

附录

致谢