柑橘全爪螨细胞色素P450及其相关基因的鉴定和表达模式研究

摘要

柑橘全爪螨Panonychus citri(McGregor)是我国柑橘产区的第一大害螨，其大量发生严重影响柑橘的产量和品质，且以化学防治为主的控制措施加之该螨自身的特点（繁殖速度快、体小、活动范围小等），导致其抗性问题日益凸显。目前，对于柑橘全爪螨解毒代谢及抗药性机理的报道相对较少，且多集中在生化水平及有限基因的鉴定方面。细胞色素P450酶系作为昆虫（螨）体内一类关键解毒酶系，可代谢多种内源和外源化合物，在昆虫（螨）对杀虫（螨）剂解毒代谢过程中起着十分重要的作用。诸多研究表明，蜱螨P450与拟除虫菊酯类、有机磷类、METIs、季酮酸类、生物源类等多种杀螨剂抗性有关。国内外有关细胞色素P450酶系的研究多针对P450的特性展开，而对于酶系发挥作用的关键因子NADPH-细胞色素P450还原酶(CRP)和细胞色素b5(CYB5)的作用地位涉及相对较少。因此，对细胞色素P450酶系进行整体研究，将有利于全面理解细胞色素P450酶及其相关基因在解毒代谢过程中的作用方式和具体定位，从而为全面解析其解毒代谢及介导的代谢抗性机制奠定理论基础。
　　本学位论文以柑橘全爪螨为研究对象，围绕细胞色素P450对药剂胁迫的响应机制这一科学问题，开展了系统地研究工作。具体内容包括:从柑橘全爪螨田间种群敏感性监测出发，在掌握柑橘全爪螨抗性水平的基础上，在生化水平上比较分析了三种主要代谢酶的酶学特性，锁定细胞色素P450作为研究重点;建立了柑橘全爪螨全螨态转录组数据库，筛选鉴定出包括细胞色素P450在内的诸多解毒代谢酶基因信息;进一步克隆P450、CPR及CYB5基因的cDNA全长序列，解析这些基因在不同螨态、不同药剂胁迫及诱导条件下的表达模式，初步建立柑橘全爪螨细胞色素P450基因的真核表达体系。研究结果对于全面揭示柑橘全爪螨P450酶系的解毒代谢机制及其介导的抗药性机制具有重要的理论意义，在实践上对于制订柑橘全爪螨抗药性的治理策略亦具有重要的指导意义。本学位论文的主要研究结果总结如下:
　　1、柑橘全爪螨抗药性监测及主要解毒酶活性比较
　　1.1、柑橘全爪螨4个田间种群的抗药性测定
　　通过改进后的叶碟浸渍法，对采自重庆4个地区（北碚、璧山、忠县、武隆）的柑橘全爪螨对阿维菌素、三唑锡、哒螨灵和螺螨酯的抗性水平进行了测定。结果表明，四种不用类型杀螨剂相比较，阿维菌素的杀螨活性最强，4个种群对其敏感性水平最高，螺螨酯和哒螨灵次之，三唑锡的杀螨活性最差，4个种群对其敏感性水平最低。不同种群间相比较发现，柑橘全爪螨璧山种群对阿维菌素最为敏感，忠县和武隆种群对其敏感性最低，LC50分别是璧山种群的11倍和12倍;忠县种群对三唑锡的抗性水平最低，璧山种群抗性水平最高，但总体差异不大;对哒螨灵而言，璧山种群对其敏感性最高，武隆种群、忠县种群与璧山种群的LC50十分接近，而北碚种群对哒螨灵的抗性水平最高，与璧山种群相比其相对抗性倍数达4倍;重庆4个柑橘全爪螨种群对螺螨酯的抗性水平差异比较明显，抗性水平由高到底依次为:璧山种群、忠县种群、武隆种群和北碚种群。
　　1.2、柑橘全爪螨三种主要解毒酶活性比较
　　1.2.1、不同发育阶段主要解毒酶活性比较
　　通过微量酶标板法对柑橘全爪螨不同螨态P450s、GSTs和CarEs活性进行了测定。比较分析发现，幼螨期P450s比活力最高，分别是成螨、若螨和卵P450s活力的2.66、2.70和16.02倍，且差异显著;柑橘全爪螨若螨和成螨期GSTs活力均显著高于其它发育阶段，卵期GSTs活力最低;柑橘全爪螨幼螨期CarEs比活力最高，其次是成螨和若螨，卵期最低。以上结果也暗示P450s和CarEs可能在幼螨期主要参与对外界化合物的代谢过程，而GSTs则可能主要在成螨和幼螨期行使解毒代谢功能。
　　1.2.2、不同种群主要解毒酶活性比较
　　研究表明，P450s、 GSTs和CarEs的活力分别在北碚种群、忠县种群、忠县种群最高，但总体来看代谢酶活性变化与抗性水平之间相关程度不高，分析可能与4个地区施药背景不同、杀螨剂类型及作用靶标不同、以及不同种群间的遗传背景存在差异有关。
　　1.2.3、不同药剂胁迫下主要解毒酶活性比较
　　在生物测定的基础上，选择5种杀螨剂（阿维菌素、三唑锡、甲氰菊酯、哒螨灵和螺螨酯）及柑橘次生挥发物（柠檬醛），以LC30浓度对柑橘全爪螨处理，24 h后测定三种代谢酶的活性。结果表明，经不同药剂处理后P450活性均有不同程度的提高，其中经螺螨酯处理后P450的活力最高;对于GSTs而言，除阿维菌素外，其余5种药剂均能显著诱导GSTs活力升高，其中螺螨酯处理后GSTs的活力最高;然而，经螺螨酯处理后，CarEs的活力显著降低，其余5种药剂处理后，其活力无显著变化。综上分析发现，P450s和GSTs对以上6种药剂的胁迫反应比较灵敏，而CarEs则较为迟钝，也暗示P450s和GSTs在一定程度上参与柑橘全爪螨对上述药剂的代谢过程。
　　1.2.4、巴比妥酸钠对主要解毒酶的诱导效应
　　柑橘全爪螨经P450酶特异性诱导剂巴比妥酸钠(19.96 mg/L)诱导24 h后，P450s和GSTs活性显著上升，而CarEs活性则被显著抑制。
　　2、柑橘全爪螨转录组分析及解毒酶基因鉴定
　　2.1、全螨态转录组数据库建立及数据分析
　　为尽可能全面获得柑橘全爪螨的基因转录本信息，提取获得柑橘全爪螨4个螨态的高质量RNA，并基于Illumina HiseqTM2000平台进行测序，将数据提交至NCBI的SRA数据库，登录号为SRA045743.1。序列分析发现共获得51，214，018条clean reads，经过一系列组装拼接后，得到65，149条Unigene。将所有Unigene提交至nr、Swiss-Prot、KEGG、COG和GO数据库进行BLASTX比对，以E=10-5为阈值，分别有32，535、25，813、22，725、15，412和10，421条Unigene成功得到注释。对nr数据库成功注释的Unigene进行同源性分析，发现柑橘全爪螨Unigene与昆虫纲相关基因的亲缘关系最近，其中9％的Unigene与赤拟谷盗Triboliumcastaneum相关基因的同源性最高，其次为印度跳蚁Harpegnathos saltator(6％)和佛罗里达弓背蚁(5％)，与蛛形纲的肩突硬蜱Ixodes scapularis同源性亦达1.7％。
　　对柑橘全爪螨Unigene进行GO分类发现，共有10，421个Unigene在GO数据库得到注释，且被划分到生物过程、细胞组分和分子功能3大主要类别的50个功能组中。其中注释基因最多的功能组是细胞组分中的cell，有7，035个Unigene，注释基因最少的是分子功能中的channel regulator activities和细胞组分中的virion，两个功能组均只有2个Unigene。将所有Unigene在COG中比对，有15，412个Unigene被成功注释，并且被划分到25个不同的功能家族，其中注释Unigene最多的功能家族是general function prediction（3，642个），注释Unigene最少的功能家族是nuclear structure（11个）。
　　2.2、解毒酶基因筛选及代谢通路分析
　　根据nr数据库比对结果，共筛选鉴定出柑橘全爪螨与解毒代谢相关的P450Unigene79个，且分别有12、9、26和7个Unigene与CYP2、CYP3、CYP4和CYP6家族基因亲缘关系最近，其余25个Unigene与其它家族(CYP9、CYP18、CYP314和线粒体P450)基因的同源性较高。有58个P450 Unigene在KEGG数据库得到注释到，共参与16条代谢通路;筛选鉴定出柑橘全爪螨24个GSTsUnigene，分属于7个家族(delta、kappa、mu、omega、sigma、theta和zeta)，其中有19个Unigene通过在KEGG数据库注释到10条代谢通路中;筛选鉴定出柑橘全爪螨13个CarE Unigene，根据同源性分析，有4个Unigene归于Clade A，分别有3个和1个Unigene归于Clade B和D;代谢通路分析发现，仅有4个Unigene能够成功注释，且均属于同1条代谢通路。总体来看上述三种解毒酶所涉及通路大多与外源物质或药剂的代谢有关，从另一角度佐证了解毒酶的主要功能。
　　3、柑橘全爪螨P450及其相关基因的克隆与序列分析
　　基于转录组数据库中鉴定出的P450 Unigene信息，利用RACE结合RT-PCR技术，从柑橘全爪螨体内分离克隆出了11个P450基因的cDNA全长序列，提交至细胞色素P450命名委员会命名后，登录入至GenBank，其名称和登陆号分别为:CYP4CL2(JQ690089)、CYP384A2(KC201279)、CYP385C7(KJ173877)、CYP385C8(KJ173878)、CYP389D1(KC201278)、CYP392A22(KC201275)、CYP392A23(KC201276)、CYP392A24(KC201277)、CYP392A25(KJ173880)、CYP392B6(KJ173879)和CYP392F1(KC201274)。这11个P450基因的开放阅读框长度范围为1，494-1，758 bp，编码氨基酸序列在497-585 aa之间。此外，利用ProParam、TMHMM等生物信息学软件对P450蛋白组成、理化性质、跨膜区段及信号肽位点进行分析和预测，结果表明这11个P450基因均为微粒体型，也暗示可能与外源化合物的解毒代谢相关。同时，柑橘全爪螨11个P450氨基酸序列中均含有经典血红素结合位点、C螺旋、I螺旋、K螺旋和meander等保守区域的特征基序，且CYP4CL2序列中含有CYP4家族特征序列EVDTFMFA/GHDTT。
　　通过对本研究克隆获得的11个及之前本课题组获得的1个柑橘全爪螨P450基因全长序列进行同源性比对，结果发现这12个P450基因核苷酸同源性在36.47％-96.39％之间，氨基酸同源性在16.29％-96.39％之间，且相同家族基因序列的同源性较高。以从二斑叶螨基因组数据库中选取所有的75个P450基因序列作为参照，利用MEGA5.05的最大似然法构建系统发育树，结果发现柑橘全爪螨12个P450基因分属于3个集团(CYP2 Clan、CYP3 Clan和CYP4 Clan)，且相同家族基因聚在一起。
　　根据转录组数据库信息，克隆获得了柑橘全爪螨CPR及CYB5基因cDNA全长序列，GenBank登陆号分别为KJ173881和KJ173882。PcCPR和PcCYB5基因完整开放阅读框分别包含2，061和324个碱基，编码686和107个氨基酸。序列多重比对发现，柑橘全爪螨PcCPR与二斑叶螨CPR同源性最高，且在氨基酸序列中发现P450还原酶的保守功能区包括FMN结合区、FAD结合区和NADPH结合区。此外，与其它20个物种进行系统发育分析，发现按照蛛形纲、昆虫纲、哺乳动物纲和双子叶植物纲聚为4大类，PcCPR与二斑叶螨亲缘关系最近，节点自展值达100％。对CYB5进行序列分析后发现，靠近N段的血红素结合区十分保守，且PcCYB5与二斑叶螨相关基因的同源性最高。
　　4、柑橘全爪螨P450及其相关基因的表达模式解析
　　4.1、细胞色素P450基因表达模式解析
　　4.1.1、柑橘全爪螨不同发育阶段P450基因的表达模式
　　运用qPCR技术完成了对柑橘全爪螨12个具有全长序列的P450基因和14个P450 Unigene片段在不同发育阶段的表达模式解析。结果发现，26个P450基因的表达伴随柑橘全爪螨的整个生命历程，CYP4CF1、CYP4CL2、CYP392A25和CYP392B6在幼螨阶段表达量均最高，CYP385C7和CYP389D1基因则在若螨特异高表达，此外有10个Unigene也在幼、若螨阶段表达水平较高，说明以上16个基因可能过多参与到幼螨和若螨阶段对内外源物质的代谢过程中;CYP384A2和两个Unigene表达水平随龄期增长而逐渐升高，暗示基因随螨体的生长发育，解毒代谢能力也逐渐增强;此外还发现CYP392A22、CYP392A24及Unigene1146、Unigene27622在卵期高表达，推测可能与卵期抵御外界次生物质胁迫有关;而CYP385C8和CYP392F1则在螨体内呈组成型表达，在整个生长发育过程中均可能行使重要作用。
　　4.1.2、柑橘全爪螨P450基因对药剂胁迫的响应表达模式
　　在前期生物测定基础上，完成了阿维菌素、甲氰菊酯、哒螨灵和柠檬醛对柑橘全爪螨不同时间和不同浓度的胁迫处理，进而对26个P450基因进行了表达模式解析。 qPCR结果发现，柑橘全爪螨P450对阿维菌素响应幅度最大，CYP385家族基因(CYP385C7和CYP385C8)上调倍数均在25倍以上，而CYP392家族四个基因(CYP392A22、CYP392A23、CYP392A25和CYP392B6)的相对表达量也分别达到了对照的41.46、68.66、25.56和11.34倍。在时间效应方面，本研究中大多数P450基因均在药剂胁迫24 h后表达量达到最高，仅两个Unigene在胁迫前期(12h)均发生响应，CYP4CL2和CYP392F1表现出的诱导效应较为滞后;P450基因在特定浓度的高表达呈家族分布，CYP385家族两个基因(CYP385C7和CYP385C8) mRNA水平在低浓度LC10胁迫下达到最高，CYP392家族5个基因（CYP392A22、CYP392A23、CYP392A24、CYP392A25和CYP392F1）均能被亚致死浓度LC30最大程度诱导，致死中浓度胁迫下，CYP4家族基因（CYP4CF1和CYP4CL2）相对表达量达最高峰值。
　　甲氰菊酯胁迫下，大多数P450基因表达均能被诱导上调，CYP4CL2表达量上升倍数最大（4.48倍）。CYP392家族4条基因（CYP392A24、CYP392A25、CYP392B6和CYP392F1）及CYP384A2、CYP389D1均在12 h后表达水平最高，CYP4家族基因的最大诱导值出现在24 h;经LC30胁迫24 h后，CYP4CF1、CYP4CL2、CYP392A22、CYP392B6和CYP392F1基因表达量均达到最大值，且显著高于对照，CYP385C8能够被甲氰菊酯LC50浓度显著诱导，暗示了以上基因在很大程度上参与了柑橘全爪螨对甲氰菊酯的代谢过程。
　　同上述两种杀螨剂不同，柑橘全爪螨P450基因对哒螨灵的响应数目和幅度都有所降低，CYP385C7、CYP385C8和CYP392A22在哒螨灵胁迫12 h后，表达量即达到最大值，说明这三个基因在哒螨灵胁迫初期发挥主要作用，CYP4CL2和CYP392家族4个基因(CYP392A23、CYP392A24、CYP392A25和CYP392B6)表达最高峰则分别推至24 h和36h，暗示其分别在中后期参与对螨体内哒螨灵的解毒过程;低浓度胁迫下，仅CYP4CL2表达量最高，而CYP392家族3个基因和CYP385C8基因均可能参与到柑橘全爪螨对较高剂量哒螨灵的代谢过程中。
　　柠檬醛特定条件胁迫处理下，柑橘全爪螨12个具有全长序列的P450基因表达量均显著上调。绝大多数P450基因表达水平在柠檬醛胁迫24 h和36 h后达到最高峰值，说明柑橘全爪螨P450对柠檬醛响应模式相对比较滞后;此外定量结果发现高浓度柠檬醛对P450的诱导效果较为明显，LC50浓度处理下，10个P450全长基因和8个Unigene的相对表达量均达到最高峰。总体来看CYP385C7、CYP385C8、CYP392A23、CYP392B6和CYP384A2上调幅度较大，均超过8倍，相对于其它P450基因而言，可推测上述5个基因在介导柑橘全爪螨对柠檬醛解毒代谢及适应寄主环境过程中发挥主要作用。
　　4.1.3、柑橘全爪螨P450基因对巴比妥酸钠诱导响应的表达模式
　　巴比妥酸钠对多数P450基因均表现出显著的诱导效应，且诱导最大值多出现在24 h和36h后，此外发现CYP392A23、CYP392A25、CYP392B6、CYP384A2和Unigene9596的表达量同诱导浓度之间呈正相关。
　　4.2、PcCPR和PcCYB5基因表达模式解析
　　4.2.1、柑橘全爪螨不同发育阶段PcCPR和PcCYB5基因的表达模式
　　PcCPR基因在幼螨和若螨中表达水平均显著高于其它两个发育阶段，在幼螨阶段表达量最高，卵期最低，PcCPR表达模式同P450不同发育阶段酶活性变化一致，也说明了其在幼螨和若螨阶段主要参与了P450的解毒代谢过程，也反映出CPR同P450间的协同作用。PcCYB5基因则在若螨期表达量最高，其次为卵和幼螨、成螨阶段表达水平最低，暗示PcCYB5基因在若螨阶段保持较为活跃的电子传递活动。
　　4.2.2、柑橘全爪螨PcCPR和PcCYB5基因对药剂胁迫响应的表达模式
　　在阿维菌素胁迫下，PcCPR基因反应较为迅速，LC10浓度处理12h后表达量均达最大值;低浓度和高浓度的甲氰菊酯均能抑制CPR基因的表达，仅亚致死浓度能显著诱导PcCPR的表达上调;哒螨酮对PcCPR的诱导效应最为强烈，且柠檬醛不同浓度和不同时间胁迫均能使PcPCR基因表达水平升高。上述结果也说明PcCPR在很大程度上参与到P450对外源物质的代谢过程中。对于PcCYB5而言，阿维菌素、甲氰菊酯、哒螨灵和柠檬醛均能够显著诱导其表达水平升高，并且其表达模式同PcCPR基因表达量变化在时间和浓度梯度上呈现一定的互补效应，暗示PcCYB5和PcCPR协同作用保证电子传递的有序进行，共同参与到P450酶系抵御外界环境压力的过程中。
　　4.2.3、柑橘全爪螨PcCPR和PcCYB5基因巴比妥酸钠诱导响应的表达模式
　　qPCR结果发现，巴比妥酸钠均能显著诱导PcCPR和PcCYB5基因的表达，且表现出良好的诱导时间效应和浓度效应，二者表达量均随时间和浓度的增加而升高。
　　5、柑橘全爪螨P450基因的真核表达
　　运用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统，选择柑橘全爪螨2个细胞色素P450基因CYP392A24和CYP392F1，采用双酶切及DNA重组技术，构建了Bacmid-CYP392A24和Bacmid-CYP392F1病毒表达载体，实现对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda Sf9细胞的侵染和蛋白表达，后续对表达产物进行P450含量测定时，发现两个蛋白均以失活态存在，说明仍需进一步完善表达及蛋白纯化体系。而真核表达体系的构建将为今后柑橘全爪螨P450基因功能的验证和目的基因的解毒代谢能力研究奠定基础。
　　综上所述，本学位论文研究运用叶碟浸渍法对重庆4个地区柑橘全爪螨田间种群的抗性水平进行了监测，同时完成了对代谢抗性相关的三大解毒酶活性的比较研究;基于高通量测序平台，构建了柑橘全爪螨全螨态转录组数据库，针对性地筛选鉴定出了包括P450在内的主要解毒酶基因，并进行了代谢通路分析;克隆获得了柑橘全爪螨11个P450基因cDNA全长序列，以及P450酶系重要功能基因CPR和CYB5的cDNA全长序列;运用qPCR技术，系统解析了柑橘全爪螨26个P450基因（12个含有全长序列的P450基因、14个P450 Unigene片段）和CPR、CYB5基因在不同发育阶段、不同药剂胁迫及诱导条件下的表达模式，鉴定出一系列与杀螨剂和植物次生物质代谢相关的P450基因;基于Bac-to-Bac系统，建立了柑橘全爪螨P450真核表达体系。研究结果丰富了柑橘全爪螨P450酶系的基础生物学信息，为筛选与柑橘全爪螨抗性相关P450基因提供了基础数据支撑，并对从P450氧化还原作用系统上全面阐述其介导的代谢抗性机制具有重要的理论和实践意义。

目录

论文说明

声明

摘要

第一章 文献综述

1 柑橘全爪螨的为害现状及抗性问题

2 昆虫(螨)抗性机制的研究

3 细胞色素P450酶系

4 转录组学在昆虫(螨)抗药性研究中的应用

5 昆虫杆状病毒表达系统在P450功能研究中的应用

前言

1 论文的研究背景及意义

2 论文的研究思路与总体框架

第二章 柑橘全爪螨抗药性监测及主要解毒酶活性比较

第一节 柑橘全爪螨四个种群田间抗药性测定

1 材料与方法

2 结果与分析

3 小结

第二节 柑橘全爪螨主要解毒酶活性比较

1．材料与方法

2 结果与分析

3 小结

本章讨论

1 田间种群抗性监测

2 主要解毒酶活性研究

第三章 柑橘全爪螨转录组数据库建立和解毒酶基因的筛选鉴定

1 材料与方法

1．1 供试螨源

1．2 供试主要试剂(盒)和仪器

1．3 柑橘全爪螨总RNA的提取

1．4 柑橘全爪螨转录组测序及数据分析

1．5 解毒酶基因鉴定及通路分析

2 结果与分析

2．1 柑橘全爪螨总RNA的提取质量

2．2 柑橘全爪螨转录组测序情况分析

2．3 功能注释

2．4 柑橘全爪螨解毒酶基因鉴定及通路分析

3 小结

本章讨论

第四章 柑橘全爪螨细胞色素P450及其相关基因的克隆与序列分析

第一节 基于转录组数据的柑橘全爪螨P450基因cDNA的克隆及序列分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 小结

第二节 柑橘全爪螨细胞色素P450还原酶和细胞色素b5基因cDNA的克隆及序列分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 小结

本章讨论

1 细胞色素P450的集团分类及同源结构分析

2 细胞色素P450还原酶和细胞色素b5的分子生物学特性

第五章 柑橘全爪螨细胞色素P450及其相关基因的表达模式研究

第一节 柑橘全爪螨P450基因的表达模式解析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 小结

第二节 柑橘全爪螨CPR和CYB5基因的表达模式解析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 小结

本章讨论

1 细胞色素P450基因的表达模式

2 细胞色素P450还原酶和细胞色素b5基因的表达模式

第六章 柑橘全爪螨细胞色素P450基因的真核表达

1 材料与方法

1．1 供试主要试剂盒和仪器

1．2 细胞培养

1．3 PCR扩增及pMD-19T Simple载体构建

1．4 表达载体构建

1．5 细胞转染及病毒株获取

1．6 P450重组蛋白表达及含量测定

2 结果与分析

2．1 柑橘全爪螨P450基因与pMD-19T Simple重组载体构建

2．2 pFastBac-CYP392A24和pFastBac-CYP392F1重组质粒的构建

2．3 Bacmid-CYP392A24和Bacmid-CYP392F1重组杆粒的构建

2．4 重组杆粒对昆虫细胞的转染

2．5 CYP392A24和CYP392F1重组蛋白的表达及含量测定

3 小结

本章讨论

第七章 主要结论、创新点及研究展望

1 主要结论

1．1 明确了重庆地区柑橘全爪螨对主要药剂的抗性水平

1．2 掌握了主要解毒酶系在柑橘全爪螨不同螨态和不同药剂下的活性变化情况

1．3 构建了柑橘全爪螨全螨态转录组数据库

1．4 筛选鉴定出了柑橘全爪螨主要解毒酶基因和代谢通路信息

1．5 克隆获得了柑橘全爪螨11个P450基因及CPR和CYB5基因

1．6 解析了P450及CPR、CYB5基因在不同螨态的表达模式

1．7 明确了P450及CPR、CYB5基因对不同药剂胁迫及诱导的响应模式

1．8 初步构建了柑橘全爪螨P450的真核表达体系

2 创新点

3 展望

参考文献

在读期间发表论文目录及参研课题情况

致谢