转基因干涉ie-2和lef-3基因对BmNPV体外增殖的影响

摘要

家蚕核型多角体病毒是蚕业生产上最常见且危害最严重的一类病原微生物，对其研究具有重要的科学意义和产业应用价值。本实验选择了家蚕核型多角体病毒的早期表达基因ie2及晚期表达因子lef3这两个与病毒复制、增殖密切相关的基因作为抑制靶标，通过构建能稳定转录形成靶标基因dsRNA的转基因干涉载体(pigA3EGFP-39KPie2，pigA3EGFP-39KPlef3，pigA3EGFP-IE1Plef3)转染家蚕胚胎细胞系(BmE)。通过G418的压力选择，获得能稳定产生dsRNA的三种转基因细胞系。线性化修饰过的病毒Bm-BacPAK6和野生型BmNPV的攻毒试验表明：转基因细胞能产生目标基因dsRNA，对病毒在细胞中的复制、增殖均有一定的抑制作用。
　　 本实验具体研究内容如下：
　　 (1)、靶基因片段的克隆
　　 克隆了家蚕核型多角体病毒(BmNPV)复制和增殖过程中的比较重要的两个基因——极早期表达基因ie-2和晚期表达因子lef-3的部分区域：ie-2基因的+623～+1186区域(共564bp)和lef-3基因的+233～+926区域(共694bp)的片段。
　　 (2)、转基因干涉载体的构建
　　 利用包含两个不同启动子——极早期表达基因ie-1的启动子和迟早期基因39k的启动子的载体骨架，将目的基因片段以反向串联方式连接，构建转基因干扰载体pigA3-EGFP-39KPie2、pigA3-EGFP-39KPlef3和pigA3-EGFP-IE1Plef3。这些载体上都含有EGFP作为报告基因，以neo作为抗性筛选标记。
　　 (3)、筛选并获得转基因干涉细胞系
　　 对实验室保存的对BmNPV敏感的家蚕胚胎细胞系(BmE)进行转染，并通过抗生素G418压力筛选获得了稳定表达干涉靶基因相应dsRNA的转基因细胞。
　　 (4)、转基因干涉载体对病毒体外增殖的影响
　　 分别接种线性化修饰过的家蚕核型多角体病毒Bm-BacPAK6和野生型BmNPV，研究稳定转化细胞的抗病能力。研究结果表明：转基因细胞能产生目标基因dsRNA，对病毒在细胞中的复制、增殖均有一定的抑制作用，对病毒的抑制效果依次为：pigA3-EGFP-39KPie2＞pigA3-EGFP-IE1Plef3＞pigA3-EGFP-39KPlef3.

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 文献综述

1.1 杆状病毒的分类与命名

1.2 杆状病毒的分子生物学特征

1.2.1 杆状病毒基因组大小与结构

1.2.2 杆状病毒的基因表达调控与基因功能

1.3 杆状病毒的感染途径和增殖方式

1.3.1 杆状病毒的感染途径

1.3.2 杆状病毒的增殖方式

1.4 RNAi研究进展

1.4.1 RNAi的发现

1.4.2 RNAi的分子机制和特点

1.5 RNAi在抗BmNPV方面的研究进展

第二章 引言

2.1 研究背景和研究意义

2.2 研究的主要内容

2.3 主要技术路线

第三章材料与方法

3.1 实验材料

3.1.1 材料

3.1.2 主要试剂及耗材

3.1.3 主要溶液及配制

3.1.4 主要仪器设备

3.1.5 生物信息学分析工具

3.2 实验方法

3.2.1 病毒的扩增

3.2.2 BmNPV DNA的提取

3.2.3 感受态细胞的制备

3.2.4 干扰载体的构建

3.2.5 转基因家蚕细胞的培养和筛选

3.2.6 表达dsRNA的转染细胞对BmNPV复制增殖的影响的检测

第四章结果与分析

4.1 转基因干涉载体的构建

4.2 瞬时表达dsRNA的BmE细胞对病毒增殖的影响

4.3 稳定表达dsRNA的转基因细胞对病毒增殖的影响

4.3.1稳定表达dsRNA的BmE细胞对修饰性病毒Bm-BacPAK6的增殖影响

4.3.2稳定表达dsRNA的BnE细胞对野生型BmNPV增殖的抑制作用

第五章讨论

5.1 启动子的选择对dsRNA干涉的影响

5.2 靶基因的选择对dsRNA干涉的影响

第六章小结

参考文献

附录：缩略语表

在校期间发表的论文

致谢