转基因干涉BmNPV病毒的gp64与lef-1基因片段对病毒体外增殖的影响

摘要

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)是蚕业生产上最常见且危害最严重的一类病原，一旦爆发对蚕业影响巨大，如何增强家蚕对该病毒的抗性一直是蚕业研究的热点。BmNPV病毒基因组全序列的测定让我们对这一病原认识得愈发清晰，某些必需基因对BmNPV病毒的增殖复制起着关键作用。因此，抑制这些必需基因的功能性表达成为防治家蚕感染BmNPV的一种有效策略。双链RNA介导的干扰现象能够特异的介导靶标基因表达沉默，是生物界进化保守且古老的抗病毒机制。本研究选择家蚕核型多角体病毒侵染传播过程中具有关键作用的gp64基因和病毒晚期表达调控基因lef-1作为靶标，通过转基因技术与RNAi技术的结合，探讨两个基因片段相应dsRNA对病毒体外复制、增殖的影响，为日后培育家蚕抗病毒品系奠定基础。本研究主要获得了如下研究结果：
　　 1.干涉靶基因的克隆及转基因干扰载体的构建
　　 根据已报道的BmNPV病毒基因组序列，分别设计引物克隆了gp64基因+233～+867区域和lef-l基因+85～+754区域的反向互补片段，经测序验证正确后将目的基因片段以反向串联方式分别连入包含两个不同诱导型启动子39K Promoter、LEF3 Promoter的载体骨架中，构建了四个转基因干扰载体并分别将其命名为pigA3-EGFP-39KPgp64、pigA3-EGFP-39KPlefl和pigA3-EGFP-LEF3Pgp64、pigA3-EGFP-LEF3Plef1。
　　 2.培养稳定表达目的基因相应dsRNA的转基因细胞
　　 将获得的质粒载体转染家蚕胚胎细胞系BmE和卵巢细胞系BmN-SWU1，利用G418对转染后的细胞进行两个半月至三个月的压力筛选，获得了稳定持续表达靶基因相应dsRNA的转基因细胞系。转基因细胞的荧光率从转染初期的10％左右分别达到70％和80％左右。
　　 3.靶基因dsRNA对病毒体外增殖的影响
　　 靶基因dsRNA对病毒增殖表现出较好的抑制作用，gp64相应dsRNA的干涉效果优于lef-1基因的相应dsRNA。在滴度为10-3病毒感染后72h时，表达两个靶基因dsRNA的转化细胞中病毒增殖量均比对照低50％左右。野生型BmNPV在转基因细胞中的增殖也受到明显抑制：同时遭受病毒感染的细胞中，荧光细胞不论是感染率还是生成的多角体个数，均低于不发荧光的正常细胞。

目录

文摘

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声明

第一章文献综述

1.1家蚕核型多角体病毒概述

1.1.1家蚕核型多角体病毒的分类地位和发育循环

1.1.2家蚕核型多角体病毒的危害与防治

1.2家蚕核型多角体病毒的表达调控机制

1.2.1杆状病毒基因表达的级联调控模式

1.2.2家蚕核型多角体病毒的其他重要基因

1.2.3 gp64基因与lef-1基因在BmNPV侵染过程中的主要作用及研究进展

1.3 RNAi抑制家蚕杆状病毒增殖复制的研究

1.3.1 RNAi的发现与发展

1.3.2 RNAi的作用机制与作用特点

1.3.3 RNAi技术在昆虫抗病毒方面的应用与展望

第二章 引言

2.1研究背景和研究意义

2.2研究的主要内容

2.3主要技术路线

第三章材料和方法

3.1实验材料

3.1.1材料

3.1.2主要试剂及耗材

3.1.3主要溶液及配方

3.1.4主要仪器设备

3.1.5生物信息学分析工具

3.2实验方法

3.2.1病毒扩增

3.2.2病毒基因组的提取

3.2.3感受态细胞的制备

3.2.4干扰载体的构建

3.2.5转基因家蚕细胞的培养和筛选

3.2.6检测表达dsRNA的转染细胞对病毒增殖复制的抑制作用

第四章结果与分析

4.1转基因干扰载体的构建

4.2瞬时表达dsRNA的BmE细胞对病毒增殖的抑制作用

4.3稳定表达dsRNA的转基因细胞对病毒增殖的抑制作用

4.3.1稳定转化的BmE细胞对Bm-BacPAK6病毒的抑制作用

4.3.2稳定转化的BmN-SWU1细胞对Bm-BacPAK6病毒的抑制作用

4.3.3稳定表达dsRNA的BmE细胞对野生型BmNPV增殖的影响

第五章讨论

5.1靶基因的选择、克隆与干扰载体构建

5.2稳定转化细胞的筛选

5.3靶基因dsRNA对病毒增殖的抑制

第六章小结

参考文献

附录：本文缩略语表

在校期间发表的论文

致谢