三种杨树再生体系的建立及三倍体银中杨转YUCCA1基因的研究

摘要

杨树是杨柳科(Salicaceae)杨属(Populus)植物的统称，具有早期速生、适应性强、分布广、种类和品种多、容易杂交、容易改良遗传性、容易无性繁殖等特点，广泛用于生态防护林、三北防护林、农林防护林和工业用材林，同时也是道路绿化、园林景观的优秀树种。而且，杨树作为速生树种之一，世界范围内栽培广泛，遗传资源丰富，无性再生能力强，生长迅速，轮伐周期相对较短，被普遍认为是未来生物能源的重要物种之一。但是依靠常规育种方法，育种周期长，工序复杂，且受气候、地域和水分等的影响，选育新品种难度大，难以满足有目的定向培育杨树新品种的需要。自80年代以后，现代分子生物学技术，尤其是基因工程技术的发展给杨树育种带来了前所未有的变革，极大地提高了育种效率和扩展了育种目标。至今为止，杨树转基因育种工作已开展二十多年，虽然转基因技术已日渐成熟，但仍存在缺乏转化受体系统及转化率低等问题。因此，建立高效稳定的杨树离体再生体系和遗传转化体系，可为进一步进行转基因育种和基因功能快速验证提供技术平台，具有重要的科学意义。
　　 本研究以三倍体银中杨(Triploid Populus alba×P.berolinensis)、中林46杨(P.deltoides Cl.‘Zhonglin46’)、西丰杨25号(P.deltoldes Bartr.×P.cathayana Rehd.Cl.'Xifeng-25')三个杨树品种为试验材料，通过对不同培养阶段最佳培养基的筛选，建立了其稳定高效的再生体系，并在此基础上，以三倍体银中杨试管苗叶片为受体材料，利用根癌农杆菌介导法转化YUCCA1基因，对影响三倍体银中杨转化效率的主要因素进行了研究，研究结果如下：
　　 1、三种杨树高效再生体系的建立：以三倍体银中杨、中林46杨和西丰杨25号带芽茎段为外植体，通过一系列试验，建立了三种杨树的高效再生系统，筛选出三种杨树不同阶段最佳培养基与激素浓度分别为：
　　 (1)三倍体银中杨：①初代培养：1/2MS+TDZ0.02 mg·L-1(单位下同)+NAA0.05，10 d后腋芽萌发，30 d后腋芽萌发率可达96％，芽平均长度为6.0 cm；②继代培养：MS+BA0.05+NAA0.02，30 d后分化率可达100％，茎高为3.5 cm，60 d后茎高达7.0 cm；③生根培养：1/2MS+NAA0.05+IBA0.20，20 d后生根率可达100％。
　　 (2)中林46杨：①初代培养：1/2MS+BA7.5+NAA0.05+TDZ0.02，10 d后腋芽萌发，30 d后腋芽的萌发率为88％，芽平均长度为4.0 cm；②继代增殖培养：MS+BA0.5+NAA0.05+IBA0.1，30 d后分化率可达92％，平均不定芽数10.2个；③壮苗培养：MS+BA0.1+IBA0.3，30 d后茎高3.5 cm，壮苗率为90％；④生根培养：1/2MS+NAA0.01+IBA0.3，20 d后生根率可达93％;
　　 (3)西丰杨25号：①初代培养：1/2MS+TDZ0.02+NAA0.05，10 d后腋芽萌发，30 d后腋芽的萌发率为94％，芽平均长度为5.0 cm；②继代增殖培养：MS+TDZ0.02+NAA0.05，30 d后分化率可达96％，平均不定芽数12.1个；③壮苗培养：MS+BA0.02+NAA0.02，30 d后茎高5.0 cm，壮苗率为92％；④生根培养：1/2MS+NAA0.02+IBA0.3，20 d后生根率为90％。
　　 上述培养基均添加25 g·L-1蔗糖、7 g·L-1琼脂，pH值为5.8，培养温度(25±2)℃，光照度2000 lx，光照时间12-14 h·d-1。
　　 2、三倍体银中杨遗传转化受体系统的建立：以三倍体银中杨试管苗叶片为外植体，建立了叶片不定芽再生体系，并在此基础上，确定了不定芽再生和生根的卡那霉素(Km)选择压及抑菌抗生素浓度。结果表明，三倍体银中杨最佳叶片不定芽再生培养基为1/2MS+BA0.6+NAA0.1+25 g·L-1蔗糖+7 g·L-1琼脂，不定芽再生率达99.4％，每叶平均生芽数约10.1个；叶片不定芽再生和生根的Km选择压均为50 mg·L-1；mg·L-1，且不会影响叶片不定芽的再生及生根。
　　 3、三倍体银中杨遗传转化条件的优化：以银中杨试管苗叶片为受体材料，研究了预培养时间、侵染菌液浓度、侵染时间、共培养时间、共培养基中添加乙酰丁香酮浓度、选择方式6个因素对三倍体银中杨遗传转化效率的影响。结果显示三倍体银中杨最优转化条件为：叶片预培养2 d，OD600nm=0.6的菌液侵染20 min，共培养4 d，共培养基中添加乙酰丁香酮50μmol·L-1，共培养后延迟14 d选择。经过不定芽再生选择培养和不定芽生根选择培养，共获得62株Km抗性植株。
　　 4、Km抗性植株的PCR检测：将获得的62株Km抗性植株进行PCR检测，结果显示有16株呈阳性反应，初步证明YUCCA1基因已被导入到三倍体银中杨基因组中。
　　 综上所述，本研究以三倍体银中杨、中林46杨和西丰杨25号为试验材料，在建立其稳定高效再生体系的基础上，采用根癌农杆菌介导法对三倍体银中杨进行了YUCCA1基因的遗传转化研究，建立了具有一定转化率的三倍体银中杨遗传转化体系，为进一步进行杨树转基因育种工作提供了科学依据。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第1章文献综述

1.1引言

1.1.1研究背景

1.1.2杨树品种简介

1.1.3生长素与YUCCA基因

1.2杨树组织培养研究

1.2.1杨树组织培养的历史和现状

1.2.2影响杨树组织培养再生效率的因素

1.2.3杨树组织培养的意义

1.3杨树遗传转化研究进展

1.3.1杨树遗传转化方法

1.3.2影响根癌农杆菌转化效率的主要因素

1.3.3杨树生长转基因研究进展

1.3.4杨树转基因存在的问题和应用前景

1.4研究目的和意义

1.5研究技术路线

第2章三倍体银中杨等高效再生体系的建立

2.1材料与方法

2.1.1材料

2.1.2方法

2.2结果与分析

2.2.1三倍体银中杨组织培养再生体系的建立

2.2.2中林46杨组织培养再生体系的建立

2.2.3西丰杨25号组织培养再生体系的建立

2.3讨论

2.3.1外植体的选择与处理

2.3.2不同培养阶段基本培养基的选择

2.3.3不同杨树品种组织培养再生体系的差异

2.3.4TDZ在组织培养中的作用

第3章三倍体银中杨遗传转化受体系统的建立

3.1材料与方法

3.1.1材料

3.1.2方法

3.2结果与分析

3.2.1诱导叶片不定芽再生的最佳分化培养基的确定

3.2.2叶片不定芽再生的最适卡那霉素选择压的确定

3.2.3不定芽生根的最适卡那霉素选择压的确定

3.2.4农杆菌对羧苄青霉素的敏感性试验

3.2.5羧苄青霉素对叶片不定芽再生的影响

3.2.6羧苄青霉素对不定芽生根的影响

3.3讨论

3.3.1不同因素对叶片不定芽诱导的影响

3.3.2卡那霉素临界浓度的选择

第4章三倍体银中杨遗传转化条件的优化

4.1材料与方法

4.1.1材料

4.1.2方法

4.2结果与分析

4.2.1预培养时间对三倍体银中杨转化效率的影响

4.2.2菌液浓度对三倍体银中杨转化效率的影响

4.2.3侵染时间对三倍体银中杨转化效率的影响

4.2.4共培养时间对三倍体银中杨转化效率的影响

4.2.5添加乙酰丁香酮对三倍体银中杨转化效率的影响

4.2.6选择方式对三倍体银中杨转化效率的影响

4.3讨论

4.3.1不同因素对转化效率的影响

4.3.2转化受体材料的选择

4.3.3分级筛选的作用

第5章转YUCCA1基因三倍体银中杨的分子检测

5.1材料与方法

5.1.1材料

5.1.2方法

5.2结果与分析

5.2.1叶片总DNA的提取

5.2.2 Km抗性植株的PCR检测

5.3讨论

5.3.1选择方式对转化效率的影响

5.3.2 Km选择压对转化效率的影响

第6章主要结论

6.1三倍体银中杨等高效再生体系的建立

6.2三倍体银中杨遗传转化受体系统的建立

6.3三倍体银中杨遗传转化的研究

参考文献

致谢

硕士在读期间发表论文及参研课题