高温诱导杨树大孢子染色体加倍选育杨树三倍体的方法

摘要

本发明公开了一种高温处理诱导杨树大孢子染色体加倍选育杨树三倍体的方法，该方法依次包括：对发育到一定时期的杨树母本雌花芽用超过其正常生长的温度进行处理，用杨树父本的花粉对雌花序进行杂交授粉，果序管理，收获种子，播种育苗，对苗木进行染色体检测，筛选出杨树三倍体植株；其中，当杨树母本雌花芽大多数的大孢子母细胞减数分裂的分裂相处于双线期到终变期时，对杨树雌花芽用超出其正常生长的温度进行处理。本发明方法明确了高温处理诱导杨树大孢子染色体加倍的最佳处理时期和处理条件，对有效处理时期做到了相对精确控制，增加了选育杨树三倍体的准确性和稳定性，提高杨树三倍体的诱导效率，节约了实验材料和人力。

说明书

技术领域

本发明涉及一种选育植物多倍体的方法，尤其涉及一种通过在大孢子母细胞减数分裂的特定阶段进行高温处理，以相对准确、高效的诱导杨树大孢子染色体加倍进而选育杨树三倍体植株的方法，属于植物遗传育种领域。

背景技术

自然界植物多倍体的发生均来自于细胞核内染色体组的倍数变异，即体细胞分裂过程中偶然发生的染色体加倍以及减数分裂过程中产生未减数配子。人工诱导染色体加倍可采取秋水仙碱溶液等化学诱导方法以及异常温度等物理诱导方法。而人工获得多倍体的途径包括体细胞染色体加倍、不同倍性体间杂交、天然或人工未减数配子杂交、胚乳培养与细胞融合等。

与利用2n花粉相比，由于利用2n雌配子不存在单倍性配子竞争问题，受精后2n雌配子可100％形成三倍体，因此采用2n雌配子选育三倍体更具诱惑力。其中2n雌配子诱导包括大孢子染色体加倍和胚囊染色体加倍。在诱导胚囊染色体加倍选育三倍体研究方面，康向阳等(2004)(康向阳，张平冬，高鹏，赵芳.秋水仙碱诱导白杨三倍体新途径的发现[J].北京林业大学学报，2004，26(1)：1-4.)对授粉一定时期的毛新杨、银腺杨雌花序进行秋水仙碱溶液处理，获得了一批白杨三倍体植株，三倍体诱导得率最高达57.1％；经过细胞学观察证明，授粉后施加秋水仙碱处理诱导银腺杨等杨树三倍体的细胞学机理是胚囊染色体加倍。王君等(2004)(王君，康向阳，李代丽，杨伟光.授粉后施加秋水仙碱处理诱导青杨派异源三倍体.北京林业大学学报，2007，29(5)：18-21.)通过秋水仙碱处理诱导胚囊染色体加倍，在世界上首次获得来源于雌配子人工染色体加倍的青杨杂种三倍体，三倍体诱导得率最高达66.7％。

就诱导大孢子染色体加倍选育三倍体研究而言，Dwivedi等(1989)(Dwivedi NK，Suryanarayana N，Sikdar AK，Susheelamma BN，Jolly MS.Cytomorphological studies in triploid mulberry evolved bydiploidizaion of female gamete cells[J].Cytologia，1989，54(1)：13-19.)在桑树上曾利用秋水仙碱成功诱导产生2n雌配子，并获得了三倍体。李云等(2000)(李云，朱之悌，田砚亭，张志毅，康向阳.极端温度处理白杨雌花芽培育三倍体植株的研究[J].北京林业大学学报，2000，22(5)：7-12.)利用极端温度诱导2n雌配子在白杨上获得了成功，将水培1-5d雌花枝放于高温(40℃或44℃)或低温(4℃或-2℃)处理一段时间，授粉杂交培育出三倍体。李云(2001)(李云，朱之悌，田砚亭，张志毅，康向阳.秋水仙碱处理白杨雌花芽培育三倍体植株的研究[J].林业科学，2001，37(5)：68-74.)报道采用0.25％-0.5％浓度的秋水仙碱处理水培1-5d的雌花芽，授以正常花粉获得了三倍体植株。但与花粉染色体加倍相比，由于大孢子母细胞减数分裂进程不能即时观察，难以确定影响雌配子染色体加倍的减数分裂有效处理时期，因此，有关雌配子染色体加倍研究主要是通过对大批量材料的处理及筛选，工作量大，而三倍体得率却较低，且可重复性较差，从而限制了2n雌配子诱导及其育种应用。李艳华等(李艳华，马洁，康向阳.白杨大孢子母细胞减数分裂进程及其即时判别[J].北京林业大学学报，2005，27(2)：70-74；李艳华，康向阳.诱导大孢子染色体加倍选育白杨杂种三倍体[J].北京林业大学学报，2007，29(5)：22-25.)利用雌、雄花芽发育进程的时序性、相关性，以雄配子发育进程为参照，相对准确地解决了秋水仙碱化学处理诱导白杨大孢子染色体加倍的有效处理时期即时判别的技术方法问题；并进一步采用雄配子发育进程为参照，在大孢子母细胞减数分裂粗线期适时进行秋水仙碱加倍处理，获得了高达16.7％的三倍体诱导得率。但该方法在加倍杨树缺少对照雄株时难以应用，而雌株与雄株所处环境差异较大时的误差也较大。

由于花粉母细胞减数分裂进程可以即时观察，一些高温诱导植物2n配子主要集中在花粉染色体加倍方面。Mashkina等(1989)(Mashkina OS，Burdaeva LM，Belozerova MM，Vyunova LN.Method of obtaining diploidpollen of woody species[J].Lesovedenie，1989，1：19-25.)将花粉母细胞处于不同发育阶段的欧洲赤松与几种杨树的雄花枝至于恒温箱中，高温处理诱导花粉染色体加倍，在杨树中取得了高达94.4％的2n花粉，并用2n花粉杂交得到了三倍体。张志毅和李凤兰(1992)(张志毅，李凤兰.白杨染色体加倍技术研究及三倍体育种(I)——花粉染色体加倍技术[J].北京林业大学学报，1992，14(增3)：52-58.)用40℃处理毛新杨雄花芽，获得了高达66.25％的大花粉比率。康向阳等(2000)(康向阳，朱之悌，张志毅.高温诱导白杨2n花粉有效处理时期的研究[J].北京林业大学学报，2000，22(3)：1-4.)研究发现高温诱导杨树2n花粉在花粉母细胞减数分裂终变期-中期I处理效果最好，最高可获得87.6％的2n花粉，但花粉量较少。高鹏(2006)(高鹏.杜仲配子与合子染色体加倍技术研究[D].北京：北京林业大学，2006.)在花粉母细胞减数分裂终变期-中期I用“树木高温加倍器”高温诱导杜仲花粉染色体加倍，获得了较高比率的2n花粉。

目前，高温诱导植物大孢子染色体加倍选育三倍体的有效处理时期尚未揭示，在有效处理时期内的高温处理条件也尚未明确；而杨树缺少参照雄株或雌株与雄株所处环境差异较大时的大孢子染色体加倍有效处理时期即时判别方法也未解决。因此，解决高温诱导植物大孢子染色体加倍选育三倍体的有效减数分裂处理时期以及相关技术问题，形成有效的大孢子染色体加倍选育三倍体诱导技术支撑体系，对于实现高温诱导植物大孢子染色体加倍选育三倍体的稳定性和高效率，以及将该方法引入其它植物的三倍体诱导等具有重要的实际价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是确定高温处理诱导杨树大孢子染色体加倍选育三倍体的有效处理时期以及处理条件，从而提供一种系统而高效的高温诱导大孢子染色体加倍选育杨树三倍体的方法，该方法在高温处理诱导杨树三倍体方面具有相对准确性、稳定性、高效性。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种高温处理诱导杨树大孢子染色体加倍选育杨树三倍体的方法，依次包括：通过常规细胞学观察解决杨树母本雌花芽外部形态与大孢子母细胞减数分裂时期的对应关系，在雌花芽发育到一定时期用超出其正常生长的温度进行处理，用杨树父本的花粉进行杂交授粉，果序管理，收获种子，播种育苗，对苗木进行染色体检测，筛选出三倍体杨树植株；其中，当杨树雌花芽的外部形态处于与大孢子母细胞减数分裂双线期到终变期相对应的形态时，对杨树母本雌花芽用超出其正常生长时的温度进行处理；

为了达到更好的诱导效果，对杨树雌花芽所施加处理的温度优选为38-44℃，更优选为41-44℃，最优选为44℃；所述的处理时间优选为3-5小时，更优选为5小时。

本发明人通过试验发现，当杨树雌花芽的外部形态处于与大孢子母细胞减数分裂双线期到终变期相对应的形态时，对杨树雌花芽施加高温处理诱导三倍体的效果最好(试验证明：此时哲引3号杨处理所获得的三倍体植株约占获得杂种后代总数的65％)。

其中，所述的杨树母本优选为哲引3号杨(P.pseudo-simonii×P.nigra‘Zheyin3#’)，所述的杨树父本优选为北京杨(P.×beijingensis)；

本发明人结合组织切片观察发现，当杨树雌花芽的大多数大孢子母细胞减数分裂的分裂相处于双线期到终变期时，此时，杨树雌花芽的所对应呈现的外部形态是：芽鳞张开，花序微露。

其中，所述的“大多数”是指占大孢子母细胞总数的百分比超过50％以上；

本说明书附图中给出了哲引3号杨雌花芽的外部形态处于芽鳞张开，花序微露的形态时的参考状态图(状态III)，该图仅供本领域技术人员参考，而不是评价所有杨树雌花芽处于大孢子母细胞减数分裂双线期到终变期相对应的形态时的依据，本领域技术人员可根据杨树雌花芽的外部形态并结合其大孢子母细胞减数分裂观察(例如：定时用FAA固定液固定植物若干雌花，结合常规切片观察统计每一雌花发育形态下的大孢子母细胞减数分裂各时期的比率)来准确评判该种杨树雌花芽处于大孢子母细胞减数分裂双线期到终变期时的的外部形态。

本发明方法可增加高温处理诱导杨树大孢子染色体加倍选育三倍体的准确性和稳定性，提高了杨树三倍体的诱导效率，并且还可以节约处理用的试验材料和人力等。

本发明的主要优点如下：1)明确了杨树雌花芽的外部形态处于大孢子母细胞减数分裂双线期到终变期时为高温处理诱导植物大孢子染色体加倍选育三倍体的最佳处理时期，对大孢子染色体加倍有效处理时期做到了相对精确控制，可增加高温处理诱导杨树大孢子染色体加倍选育三倍体的准确性和稳定性，提高杨树三倍体的诱导效率，并且还可以有效节约处理用的试验材料和人力等；2)本发明通过雌花芽形态发育确定大孢子母细胞减数分裂进程的技术方法，使本发明方法具有更强的可操作性，进一步节省了人力和物力，尤其对于缺少参照雄株时更为实用。

附图说明

图1‘哲引3号杨’高温诱导大孢子染色体加倍各处理花芽形态；状态I：花芽略膨大；状态II：芽鳞微张，花序未露出；状态III：芽鳞张开，花序微露；状态IV：1/3花序露出芽鳞；状态V：1/2花序露出芽鳞。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例

用‘哲引3号杨’(P.pseudo-simonii×P.nigra‘Zheyin3#’)等为母本，以‘北京杨’(P.×beijingnsis)为父本，将雌花芽区分为5种状态：状态I：花芽略膨大；状态II：芽鳞微张，花序未露出；状态III：芽鳞张开，花序微露；状态IV：1/3花序露出芽鳞；状态V：1/2花序露出芽鳞。该5种花芽发育状态分别与一定的大孢子母细胞减数分裂时期相对应(图1，表1)。

对不同发育状态下的雌花芽施加一定的超出植物发育时期内正常温度的38℃、41℃、44℃高温进行处理，处理持续时间分别为3小时、5小时。由于‘哲引3号杨’大孢子母细胞减数分裂进程的不同步性，各处理均能得到了一定数量的三倍体植株(表2)，其中尤以雌花芽处于状态III时施加处理诱导三倍体的效果最好，在此花芽发育状态下大部分大孢子母细胞减数分裂处于双线期和终变期，并含有少量中期II分裂相。雌花芽处于状态III时的全部处理获得三倍体95株，约占获得的三倍体总数的65％。

表1高温诱导‘哲引3号杨’大孢子染色体加倍同步固定的雌花芽大孢子发生进程(％)

表2高温诱导‘哲引3号杨’大孢子染色体加倍选育三倍体