布鲁氏菌vjbR基因标记疫苗株的构建、免疫保护性分析及鉴别诊断研究

摘要

布鲁氏菌病是一种在世界范围内广泛流行的人畜共患病，它的流行不仅对社会经济发展造成了严重损失，而且给人类健康带来很大威胁。减毒活疫苗是目前预防布鲁氏菌病效果最好的疫苗形式，在国内外有广泛的使用，然而，由于存在毒力残存、免疫后无法鉴别诊断等缺点，其使用受到限制。为了克服现有疫苗的这些缺点，利用敲除抗原基因的方法构建标记疫苗株，并评价标记株作为候选减毒活疫苗的可行性，已成为寻找理想减毒活疫苗的一种重要策略。
　　 根据文献报道相关标记疫苗株的研究情况，在实验室前期研究成果的基础上，本研究进一步对16MΔvjbR作为标记疫苗株的可行性进行了评价。首先采取抗性替换的方法，重新构建了vjbR抗性基因替换株，然后对标记菌株的毒力表型进行了确认，对其保护性和保护机制进行了分析。之后，进行了vjbR的体外克隆、表达，并探讨其区分疫苗免疫与自然感染的能力，建立了鉴别诊断方法。
　　 由于布鲁氏菌不含质粒，很多外源质粒均不能在细菌中复制，基于此特点，我们建立了一种快速构建布鲁氏菌无痕缺失突变体的方法，并成功构建了vjbR的突变株：将vjbR基因两侧同源臂分别与卡那抗性基因进行PCR融合，得到含有两侧同源臂和抗性基因的突变盒序列，然后利用T载体克隆，将突变盒序列克隆到T载体，将得到的重组载体转入布鲁氏菌中，通过抗性筛选得到vjbR基因被卡那基因替换的缺失标记株16MΔvjbR。
　　 用16M△vjbR标记株腹腔接种免疫小鼠，在免疫后的2、4、6周分别采集免疫小鼠血清，监测抗体产生，分离小鼠的脾脏，用菌体蛋白刺激，分析免疫后小鼠的细胞免疫，进行免疫保护性研究。实验中我们采用了疫苗株Rev.1免疫组做为阳性对照，生理盐水PBS组作为阴性对照。实验结果显示，用缺失标记株16M△vjbR免疫的BALB/c小鼠能够对野生株B.melitensis16M产生很好的免疫保护效果。同时，突变株诱导了特异性抗体IgG的分泌。其细胞免疫水平IFN-γ以及IL-10均有分泌。这说明缺失标记株16MΔvjbR能够诱导细胞免疫和体液免疫，并起到明显的保护作用。
　　 缺失标记株16MΔvjbR能否作为候选疫苗还与是否有合适的诊断抗原有关。我们对布鲁氏菌重组蛋白vjbR进行了体外表达，分别用缺失标记株16MΔvjbR、野生株B.melitensis16M免疫BALB/c小鼠，用免疫的小鼠血清与纯化的蛋白反应来评价蛋白作为诊断抗原的可能性。通过Western blot和间接ELISA法对蛋白的免疫原性进行了检测，结果显示vjbR能够作为诊断抗原，可用于区分疫苗免疫和自然感染。
　　 以上结果表明，16MΔvjbR是一个良好的候选减毒活疫苗株，值得进一步研究。