柑橘这缘属植物DNA条形码研制及其物种的鉴定研究

摘要

中国是世界柑橘最重要的起源地之一，具有丰富的柑橘资源。柑橘属于芸香科(Rutaceae)柑橘亚科(Aurantioideae)植物。自1753年林奈创立柑橘属(Citrus L.)以来，国内外学者从形态学、细胞学到分子水平进行了一系列的研究，先后建立了多个柑橘属分类系统。其中，最著名的是美国的Swingle系统，包含16个种；日本的Tanaka系统，包含159个种和3个变种；我国的曾勉系统，包含30个种。由于柑橘属植物具有种间易杂交、无融合生殖及无性变异等特点，柑橘属植物物种的数目、种间亲缘关系和分类问题是迄今尚未解决的科学难题。
　　 DNA条形码(DNA barcode)概念由加拿大动物学家Paul Hebert于2003年提出，是一种基于DNA分子进化原理，利用短的DNA片段和现代分子系统学的原理和方法对“传统物种”在分子水平进行身份鉴定的最新物种生物学技术。该技术与传统的物种鉴定方法相比，具有准确性高、效率高、不受被鉴定对象的环境、个体发育和鉴定专家个人因素影响等优点。DNA条形码技术自诞生以来，国内外学者运用线粒体细胞色素C氧化酶Ⅰ(cytochrome c oxidasesubunitⅠ，COⅠ)基因作为条形编码序列，对昆虫、鸟类、鱼类等动物进行物种鉴定和新种及隐存种的发现，取得很大的成功。但COⅠ基因在植物中的进化速率较慢，不适于植物条形码的研究。目前，国内外植物DNA条形码研究还处于寻找合适的基因片段的阶段，许多学者进行了积极的探索，报道了多种植物条形码候选片段或片段组合，但迄今仍没有找到能满足所有标准的DNA条形码特征片段。
　　 本研究选用真正柑橘果树类植物6属59个生物类型为实验材料，采用叶绿体编码基因(matK、rpoB、rpoC1、rbcL)、叶绿体间隔序列(trnH-psbA、trnG-trnS、psbH-petB、trnL-trnF)和核基因内转录间隔序列(ITS)及其间隔区(ITS1、ITS2)共9个DNA序列作为条形码候选序列，使用MEGA5.05软件计算序列的碱基组成、序列间的碱基变异频率和序列间的转换颠换频率及其比率。使用SPSS17.0软件进行wilcoxon检验比较分析不同编码序列之间的差异。通过比较序列种内和种间差异的分布，运用单一片段和组合片段分别对柑橘属Swingle系统植物、Tanaka系统植物和柑橘及其近缘属6属植物进行鉴定，比较了各单一序列及片段组合鉴定率的大小。有关研究结果如下：
　　 1.在单一序列对柑橘属Swingle系统、Tanaka系统28份材料鉴定中，以富民枳、飞龙枳、枳为外类群构建NJ距离树，比较各单一序列的鉴定率。结果表明：核基因内转录间隔序列(ITS)及其间隔区(ITS1、ITS2)序列的平均鉴定效率最高，叶绿体间隔序列(trnH-psbA、trnG-trnS、psbH-petB、trnL-trnF)次之，叶绿体编码基因(matK、rpoB、rpoC1、rbcL)的鉴定率最低。在Swingle系统中，ITS1鉴定能力最强为100％，psbH-petB、ITS序列鉴定能力次之，鉴定率均为93.8％，rpoC1序列鉴定率最低为12.5％。在Tanaka系统28份材料中psbH-petB、ITS鉴定率分别为100％，rpoC1序列最低为14.8％。
　　 2.以九里香、酒饼簕和蚝壳刺为外类群，对柑橘及其近缘属植物6属进行鉴定，构建NJ距离树，比较各单一片段的鉴定率。结果表明：ITS的鉴定率最高，达到59.3％，psbH-petB次之为55.9％，matK为50.8％，其余片段均为50％以下。综合1、2结果，核基因ITS、叶绿体间隔序列psbH-petB、叶绿体编码基因marK在相同类型的DNA序列中鉴定率最高，是柑橘及其近缘属植物DNA条形码研究的重要片段。
　　 3.结合第三届国际生物条形码的提议及前人研究组合方案和单一片段的鉴定结果，选用matK+rbcL、matK+trnH-psbA、matK+ITS、trnH-psbA+ITS、trnG-trnS+ITS2、matK+ITS2、matK+psbH-petB+trnG-trnS、matK+ITS+trnG-trnS、matK+rpoB+rpoC1片段组合为研究对象，以富民枳、飞龙枳、枳为为外类群对柑橘属Swingle、Tanaka系统28份植物构建NJ距离树，比较各组合片段的鉴定率。结果表明：在Swingle系统植物鉴定中，trnH-psbA+ITS的鉴定率最高为100％，matK+trnH-psbA、matK+ITS和trnG-trnS+ITS2次之为93.8％，matK+rpoB+rpoC1的鉴定率最低为81.3％。在Tanaka系统28份植物鉴定中，matK+ITS、trnG-trnS+ITS2及matK+ITS+trnG-trnS三者的鉴定率最高为96.3％，trnH-psbA+ITS、matK+trnH-psbA的鉴定能力均下降，分别为74.1％、51.9％。所以在利用组合片段对柑橘属Swingle、Tanaka系统28份植物鉴定中matK+ITS、trnG-trnS+ITS2的鉴定率最高。
　　 4.以九里香、酒饼簕和蚝壳刺为外类群，利用组合片段对柑橘及其近缘属植物鉴定，构建NJ距离树，比较各片段组合的鉴定率。结果表明：matK+ITS+trnG-trnS组合鉴定率最高为83.1％，matK+ITS次之为81.4％。两者鉴定率相差不大，但后者少了trnG-trnS片段，序列长度更短，鉴定效率更高。
　　 综上所述，在单一序列鉴定柑橘属Swingle系统、Tanaka系统28份材料和柑橘及其近缘属植物中，psbH-petB、ITS具有最高的鉴定率，并且psbH-petB、ITS、matK序列在相同类别的DNA序列中鉴定率最高，三者是柑橘条形码研究的重要片段；组合片段与单一片段相比，鉴定率均有较大幅度提高，matK+ITS与其它组合片段相比，具有较高的鉴定率、较短的序列长度等特点，可用于柑橘及其近缘属植物DNA条形码研究。DNA条形码技术作为一种新型的物种鉴定手段，可用于柑橘及其近缘属植物的鉴定。