人TREM-1原核表达载体构建和多克隆抗体制备及急性肺部感染患者可溶性TREM-1检测

摘要

[目的]
　　 TREM-1(Triggering receptor expressed on myeloid cells-1，TREM-1)是一种在炎症反应的触发及放大过程中具有重要作用的分子，选择表达于髓样细胞(如单核/巨噬细胞、中性粒细胞)表面，可放大促炎性细胞因子的释放，因此它在感染性疾病，脓毒症等发挥重要作用。感染早期TREM-1可以可溶性形式(soluble TREM-1，sTREM-1)释放进入体液，而且sTREM-1与感染严重程度有较好的相关性，提示sTREM-1是一种早期诊断急性肺部感染的新指标，为了进一步研究人TREM-1在急性肺部感染发生发展中的作用，我们构建TREM-1原核表达载体，表达、纯化TREM-1蛋白；进一步制备多克隆抗体，并对多克隆抗体进行鉴定；建立sTREM-1 ELISE检测方法，并检测急性肺部感染患者血清的TREM-1含量。为急性肺部感染的早期诊断及疗效评价、预后估计提供新的指标和方法。
　　 [方法]
　　 1.构建含人TREM-1胞外段目的基因的T载体克隆及原核表达载体亚克隆，经酶切、PCR和测序证实后，用IPTG诱导表达TREM-1融合蛋白，SDS-PAGE电泳鉴定，将重组基因工程菌扩大诱导表达，亲和层析法纯化诱导的TREM-1融合蛋白。
　　 2.将纯化的蛋白与弗氏完全佐剂乳化，将其作为抗原免疫家兔，获得兔抗人免疫血清，经硫酸铵盐析纯化，获得初步纯化的兔抗人TREM-1多克隆抗体，通过双扩散试验和间接ELISE方法检测多克隆抗体的效价和纯度，Western bolt对它进行鉴定。
　　 3.用商品单抗和自制多抗建立ELISE夹心法，并对方法进行条件优化，测定其准确度、精密度、重复性和线性范围，方法建立后用于检测急性肺部感染患者血清中可溶性TREM-1的含量。
　　 [结果]
　　 1.成功构建了高表达重组人TREM-1蛋白的原核表达载体，并表达具有抗原性的TREM-1融合蛋白。
　　 2.获得纯化的TREM-1融合蛋白，并用其免疫家兔，得到兔抗人TREM-1多克隆抗体。以重组蛋白为抗原，用间接ELISE检测TREM-1抗血清的效价达到1:25600，双向琼脂免疫扩散试验显示TREM-1多克隆抗体与抗原之间形成单一沉淀线，效价达到1:16，Western bolt分析TREM-1抗血清在分子量21.80KDa处与相应的原核表达蛋白呈现特异性条带，表明所制备的多克隆抗体效价较高，具有良好的纯度。
　　 3.建立可溶性TREM-1 ELISE检测方法，并对30例急性肺部感染和30例正常体检血清标本进行检测，发现急性肺部感染患者TREM-1含量明显增高。
　　 [结论]
　　 成功构建了高效表达重组人TREM-1融合蛋白的原核表达载体，获得高效稳定的重组基因大肠杆菌表达菌株，经IPTG诱导表达的TREM-1融合具有免疫原性，将其作为免疫原制备的兔抗人TREM-1多克隆抗体能与纯化的外源性TREM-1融合蛋白和天然表达的内源性TREM-1蛋白发生结合反应，检测TREM-1多克隆抗体效价、纯度、活性均达到预期要求。建立ELISE方法检测在急性肺部感染患者血清中TREM-1明显增高。