谷氨酸诱导的神经元突触活动对mTOR信号通路的调节

摘要

突触活动依赖性的蛋白质合成在突触可塑性的调节中起着关键的作用。目前已有研究显示哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammaliantarget of rapamycin,mTOR)信号通路是海马神经元细胞树突中活动依赖性的蛋白合成的主要调控路径。因此为了更加深入的研究和探讨突触活动对mTOR通路的影响及具体的调控机制,本研究拟在体外培养原代小鼠皮层神经元的基础上观察谷氨酸诱导的突触活动对mTOR通路相关蛋白表达的影响。
　　 目的:
　　 1.明确谷氨酸诱导的突触活动对原代培养的小鼠皮层神经元细胞内mTOR信号通路相关蛋白表达的影响;
　　 2.观察谷氨酸受体阻断剂及mTOR信号通路的特异性抑制剂对谷氨酸诱导的蛋白表达变化的影响。
　　 方法:
　　 在体外原代培养的C57小鼠皮层神经元细胞基础上,采用10mM谷氨酸钠处理7～8天的神经元1h以诱导突触活动,应用Western Blot法检测mTOR通路相关蛋白p70S6K(Thr389)、p-GSK3β(Ser9)、TSC2和4EBP2的变化。此外,通过采用阻断剂、抑制剂分别预处理神经元20min,再加入终浓度为10mmol/L的谷氨酸钠继续培养1h,检测阻断剂或抑制剂对谷氨酸调控作用的影响。
　　 结果:
　　 1.建立了新生小鼠皮层神经元体外培养技术,用24 h小时内新生C57小鼠,分离出大脑皮层,培养7～8天,通过免疫荧光染色方法鉴定,获得纯度较高的皮层神经元;
　　 2.发现用谷氨酸诱导神经元突触活动可以上调mTOR信号通路,表现为谷氨酸可以促进p70S6K(Thr389)的磷酸化,抑制p-GSK313(ser9)、TSC2和4E-BP2的表达,且上述蛋白表达的变化具有明显的时间和浓度依赖性。此外,用mTOR的特异性抑制剂Rapa处理细胞能够明显的阻断谷氨酸诱导的p-p70S6K磷酸化的增加;
　　 3.NMDA受体阻断剂D-APV能逆转谷氨酸诱导的mTOR的上调(*P＜0.05,**P＜0.01 vs.control;△P＜0.05,△△P＜0.01 vs.MSG),而AMPA受体阻断剂CNQX无此作用;
　　 4.LiCI抑制GSK3β的活性后能够活化mTOR通路,表现在LiC1可剂量依赖性的增加p70S6K(Thr389)的磷酸化,同时,LiC1处理能降低4E-BP2的表达。用mTOR特异性抑制剂Rapa处理细胞后阻断了LiC1诱导的p-p70S6K(Thr389)的增加(**P＜0.01 vs control),但Rapa对于LiCl诱导的4E-BP2的减少无明显影响。
　　 结论:
　　 1.本实验建立的新生小鼠大脑皮层神经元培养方法,可得到纯度较高且生物学性状稳定的神经元,为揭示神经元生理、生化和病理等方面的复杂变化提供便利;
　　 2.在神经元细胞中,谷氨酸诱导的皮层神经元突触的活动可以上调mTOR/p706SK信号通路,主要表现在促进p706SK(Thr389)的磷酸化,抑制TSC2和4E-BP2的表达,且Rapa可以阻断谷氨酸诱导的p706SK(Thr389)的增加和TSC2的减少。
　　 3.NMDA受体参与了谷氨酸依赖性的突触活动对mTOR通路的上调,而AMPA受体对于突触活动诱导的mTOR通路的活化是非必须的;
　　 4.LiCI抑制GSK-3β的活性可以活化mTOR信号通路,但是谷氨酸诱导的GSK-3β活性的上调不影响mTOR通路的活化,这提示我们GSK-3β在mTOR通路的调控中起着重要的作用。