中性植酸酶基因克隆表达、功能分析及对桑树遗传转化的研究

摘要

栽桑养蚕最早始于我国，是中华民族对人类文明的伟大贡献之一。桑树(MorusL.)属多年生双子叶木本植物，是一种重要的木本经济作物，其收获物-桑叶是家蚕的绝好饲料，是我国蚕桑丝绸产业可持续发展的重要物质基础。随着科技的发展，桑叶不仅是作为家蚕的饲料，而且已用作畜禽饲料，使桑树产业向着多元化方向发展，桑树的多用途价值已越来越受到广大科学者的关注。
　　 桑叶不仅蛋白质含量高(干物高达24％～32％)，而且也是一种含磷量较高的饲料用叶，其嫩叶(鲜物)的含磷量高达0.27％，成熟叶(鲜物)的含磷量高达0.18％。然而植物中的磷有相当部分是以植酸的形式存在，植酸是一种抗营养因子，能够抑制动物体对矿质元素的吸收。当植物性饲料被单胃动物采食后，其有机磷不能被吸收利用，而要向外排泄，污染环境水质，同时磷在动物饲料中是仅次于能量和蛋白质的第三位营养素，占有举足轻重的地位，它参与动物牙齿、骨骼及细胞膜的构成，并是遗传物质核酸的组成成分，参与重要的生长发育代谢过程。磷元素缺乏将严重影响动物生长发育，导致动物的生产性能低下，因此，如何最大程度的利用植食性饲料中所含的磷元素，是极为重要的研究课题。
　　 本研究围绕如何利用桑叶植酸磷这一课题，开展了较为深入系统的研究，并取得了较好的研究成绩，现将其研究要点总结如下：
　　 1.利用测铁分光光度法测定桑叶中植酸的含量
　　 本研究运用Design-Expert8.0.4Trial软件的Box-Behnken模型，分析不同提取条件因子对桑叶植酸提取效果的影响作用，为料液质量浓度>提取液中盐酸的浓度>浸提时间，最佳提取条件是：提取液为1.25％盐酸+10％硫酸钠，浸提时间为2.18h，料液质量浓度为0.05g/mL。采用此优化条件提取桑叶和蚕粪中的植酸，并应用比色法测定5个桑品种和5龄幼虫蚕粪中的植酸含量，5个桑品种春季成熟叶、嫩叶以及秋季成熟叶、嫩叶中的植酸平均质量比分别为3.98、3.55、3.75、3.52mg·g-1；蚕粪中植酸的含量为3.78mg·g-1，与桑叶中的植酸含量基本接近。检测结果说明桑叶中的植酸随着桑叶的成熟其含量不断增加，实验结果表明家蚕对桑叶中植酸态磷几乎不能利用。
　　 2.枯草芽孢杆菌的筛选及植酸酶phyC基因的克隆
　　 本研究以来自于西南大学后山池塘边枯草丛的土壤为材料，通过两次高温加热筛选，从中获得一株命名为WYCQ02的细菌，利用改良的schaeffer-fulton染色法对该细菌进行染色发现菌体呈红色杆状且较长，芽孢呈蓝色的椭圆形；镜检发现菌体周身长有鞭毛，具运动性，穿刺接种发现该菌为好氧性细菌，结合16SrDNA序列分析在NCBI的比对结果我们将其鉴定为枯草芽孢杆属的一种。
　　 利用NCBI中已报道的中性植酸酶基因序列设计引物，采用PCR方法，从WYCQ02菌株的基因组中克隆获得一植酸酶基因，并向NCBI提交登录，基因序列号为FJ986327，氨基酸序列号为ACR78677。该基因序列包含一完整的1152bp长的开放阅读框，编码357个氨基酸的成熟肽和26个氨基酸的信号肽。与芽孢杆菌属植酸酶的同源性较高，其二级结构含有丰富的随机卷曲和衍生链，仅有少量的α-螺旋和β-转角。利用NetNGlyc1.0在线分析软件对其N-端糖基化位点(Asn-Xaa-Ser/Thr)进行预测发现存在4个潜在的N-端糖基化位点，即分别位于氨基酸起始位点的第95位点，112位点，217位点和255位点的Asn残基均可以被糖基化，这将有利于蛋白的折叠和稳定性。
　　 3.芽孢杆菌植酸酶phyC基因的原核表达
　　 本研究根据前述基因序列的结构以及原核表达载体pET-28a(+)的多克隆位点设计引物，采用PCR方法扩增芽孢杆菌中性植酸酶phyC基因的成熟肽编码序列，然后将其克隆进原核表达载体pET-28a(+)，并转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达。在37℃条件下以0.5mmol/LIPTG诱导4h能够获得大量包涵体蛋白，在25℃条件下以0.5mmol/LIPTG诱导6h有利于可溶性蛋白的获得。利用Ni-NTA亲和纯化重组植酸酶产物，对纯化的中性植酸酶的部分酶学性质进行分析表明：该酶的最适反应温度为55℃，并具有一定的耐热性，在70℃处理10min可保持20％以上的酶活性；最适pH值在6～7之间，当pH值为5.5～9.0能保持80％以上的酶活性；该酶还具有一定的耐酸、碱能力，在pH5.0～10.0之间处理60min该酶仍能保持70％以上的活力，在pH2.0～4.0之间能保持40％以上的活力。
　　 4.芽孢杆菌植酸酶phyC基因的真核表达
　　 本研究根据芽孢杆菌植酸酶phyC基因全序列和pPIC9K的多克隆位点设计引物，采用PCR方法从pGEM-phyC质粒分别获得含信号肽的phyC基因开放阅读框和成熟肽编码序列，然后将其连接到毕赤酵母表达载体pPIC9K的多克隆位点上，利用限制性核酸内切酶SacI将表达载体pPIC9K-phyC线性化后，经Bio-RadMicroPulserTM电转仪电击转化入巴斯德毕赤酵母GS115。经菌落PCR和MD/MM平板筛选获得了阳性酵母表达菌株，利用含G418的平板筛选出phyC基因多拷贝酵母菌株后，再利用YPD-植酸钙平板筛选获得具胞外表达植酸酶活性且较高的酵母菌株，然后在BMGY和BMMY培养基中利用甲醇诱导获得了有生物学活性的芽孢杆菌植酸酶的分泌表达。表达的蛋白经Ni-NTA亲和柱纯化后，对部分酶学性质做了分析，发现其酶促反应的最适温度为55℃，pH值在7～8之间均有相当高的酶活性，并且该酶亦具有一定的耐酸性和耐碱性。通过对原核和真核表达的对比发现，真核表达的植酸酶蛋白仅在热稳定性上有所提高。由此将我们获得的phyC基因，向中华人民共和国国家知识产权局进行了发明专利申请登记，专利申请登记号：200910103029.1，并于2010年12月8日获得国家发明专利授权，专利号：ZL200910103029.1，证书号第710888号。
　　 5.芽孢杆菌植酸酶phyC基因转化桑树的初步研究
　　 在以抗生素为筛选标记的基因转化中，确定适宜的筛选压力是提高基因转化率的前提，并且还不能对外植体有所伤害。本研究通过实验确定了卡那霉素筛选浓度为50mg/L，经过前人的不少研究表明桑树是一种易感农杆菌的植物。利用本研究室多年研究优化的桑组培再生体系获得桑树外植体丛生芽，以此作为遗传转化的受体，构建pCAMBIA-2300-phyC载体，利用农杆菌介导的基因转化法，共转化丛生芽527个，得到45株phyC遗传基因转化组培桑苗。经鉴定检测，其中PCR阳性phyC遗传基因转化植株为15株，其PCR阳性率为2.85％。实验结果表明，农杆菌介导基因转化桑树是可行的。
　　 本研究借鉴本研究室李军、赵爱春等的花粉介导法将phyC基因导入红果1号和育2号杂交桑种子中，共收获1301粒种子，其中500粒种子在萌发期用卡那霉素筛选，获得64株桑苗移栽大田；另外801粒桑种，直接播种在大田中进行精心管理。最终总共获得154株遗传转化实生苗，于2011年8月至11月连续逐株进行PCR检测，共获得了11株具有PCR阳性的phyC基因转化桑苗植株，花粉介导phyC基因的PCR阳性植株与杂交桑种粒数的比例为0.85％。下一步的工作还需要对这些PCR阳性植株进行各种分子杂交技术检测，并进行酶活性的测定验证，最终获得具有植酸酶活性的遗传转化植株。