鸭心苹果酸脱氢酶的分离纯化及性质和功能基团研究

摘要

苹果酸脱氢酶(malatedehydrogenase，MDH)广泛存在于动物、植物以及微生物体内，是生物体进行糖代谢的关键酶之一，主要催化草酰乙酸和苹果酸之间进行可逆转化。根据辅酶特异性，MDH可分为NAD-依赖型MDH(NAD-MDH)和NADP-依赖型MDH(NADP-MDH)。在真核细胞中，NAD-MDH分布于细胞质和线粒体中，分别为c-MDH(cytosolicMDH)和m-MDH(mitochondrialMDH)，常以同型二聚体形式存在。
　　 MDH广泛应用于医学诊断、生物制药、农业生产、食品及发酵工业等领域。到目前为止，多种来源的MDH已得到了详细研究，但未见家禽类心脏中苹果酸脱氢酶的研究报道。因此，本文以廉价、来源广泛、容易获得的鸭心为实验材料，对鸭心所含有的两种MDH同工酶（c-MDH和m-MDH）进行了分离纯化，并对两种同工酶进行了部分酶学性质研究，旨在为该酶的获得提供一条新的途径，为MDH同工酶的深入研究及应用提供参考。其结果如下:
　　 1.鸭心苹果酸脱氢酶的分离纯化
　　 新鲜鸭心通过去血、匀浆粗提、硫酸铵沉淀、有机溶剂沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析以及Superdex-200凝胶过滤层析等常用方法，获得了电泳纯的鸭心c-MDH和m-MDH，其回收率分别为25.54％和10.98％，纯化倍数分别为69.07倍和130.40倍，酶比活力分别为849.70U/mg和1604.19U/mg。
　　 2.鸭心苹果酸脱氢酶的性质研究
　　 理化性质研究表明:鸭心c-MDH和m-MDH全酶相对分子质量均约为77.37kD、亚基相对分子质量分别为39.58kD和37.62kD，因此可以判定两种同工酶都是由2个相同亚基构成;鸭心c-MDH和m-MDH的等电点分别为6.5和6.8、最适反应温度分别为55℃和65℃、最适反应pH分别为7.2和7.5、对草酰乙酸的表观Km值分别为140.93μmol/L和263.43μmol/L;两者都在30℃以下时比较稳定，都具有较强的耐碱性。
　　 3.有机溶剂、化合物及金属离子对鸭心苹果酸脱氢酶的影响
　　 甲醇、乙醇、异丙醇、氯仿、抗坏血酸、草酸、EDTA二钠（高浓度时）、SDS、Cu2+、Ag+以及(Pb)2-、Zn2-对鸭心c-MDH和m-MDH的活性都有很明显的抑制作用;而Mg2+、K+、Ba2+对鸭心c-MDH和m-MDH的活性都表现出较强的激活作用;Ca2+对c-MDH基本上没有影响，而对m-MDH具有很强的抑制作用。
　　 4.鸭心苹果酸脱氢酶功能基团的研究
　　 对酶功能基团的修饰结果表明:半胱氨酸中的巯基、色氨酸残基是鸭心c-MDH和m-MDH活性中心的必需基团，参与了酶活性中心的构成;丝氨酸残基可能是鸭心c-MDH和m-MDH活性中心的必需基团;而甲硫氨酸的硫醚基、组氨酸的咪唑基、精氨酸残基、二硫键、酪氨酸的酚羟基、赖氨酸残基与鸭心c-MDH和m-MDH活性中心不直接相关，不是酶活性中心的必需基团。

目录

声明

论文说明

摘要

第一部分 文献综述

1．1 苹果酸脱氢酶的分类及分布

1．2 苹果酸脱氢酶的分子结构特点

1．3 苹果酸脱氢酶的催化反应机制

1．4 苹果酸脱氢酶的分离纯化

1．5 苹果酸脱氢酶的生化性质及生理功能

1．6 苹果酸脱氢酶基因工程的研究

1．7 苹果酸脱氢酶的应用

第二部分 引言

2．1 本研究的目的和意义

2．2 本实验的主要研究内容

2．3 研究技术路线

第三部分 鸭心苹果酸脱氢酶的分离纯化及酶学性质研究

3．1 材料与试剂

3．2 实验方法

3．3 实验结果与分析

第四部分 鸭心苹果酸脱氢酶功能基团的研究

4．1 实验原理

4．2 材料与方法

4．3 实验结果与分析

第五部分 讨论

5．1 鸭心苹果酸脱氢酶的分离纯化

5．2 鸭心苹果酸脱氢酶的性质研究

5．3 鸭心苹果酸脱氢酶功能基团的研究

第六部分 结论及展望

6．1 鸭心苹果酸脱氢酶的分离纯化

6．2 鸭心苹果酸脱氢酶的性质研究

6．3 鸭心苹果酸脱氢酶功能基团的研究

6．4 展望

参考文献

致谢

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