山茱萸活性成分提取分离及其治疗糖尿病并发症研究

摘要

糖尿病是由于胰岛功能障碍、胰岛素抵抗等引起的机体内碳水化合物代谢紊乱综合征。糖尿病及其并发症已经成为继心脑血管疾病、癌症之后威胁人类生命健康的第三大杀手。目前对于糖尿病及其并发症还没有可以彻底根治的药物。传统的药物治疗除了治疗费用高昂，还给病患带来很多副作用。此外，传统药物在降低血糖的同时难以兼顾糖尿病的并发症，具有相当的局限性。因此从传统中药中研究开发新的治疗糖尿病及并发症的药物成为一个研究热点。
　　 中药山茱萸(CornusofficinalisSieb.etZuee.)为山茱萸科(Cornaeeae)山茱萸属(Comus)植物的去核干燥果肉，是我国常见的药食两用型药材。山茱萸在我国用于治疗消渴症、糖尿病已有数千年的历史，因其较高的应用价值自古就受到关注，近代药理学研究，山茱萸有降血糖、免疫调节、抗氧化、抗炎、抗休克、保肝及抗癌等作用。本论文主要根据山茱萸的降糖及抗氧化活性提取分离山茱萸的有效组分及成分。以HepG2细胞、α-葡萄糖苷酶和STZ诱导的小鼠为模型，探求山茱萸抗氧化及降糖活性，研究比较山茱萸中各活性物质对糖尿病及其并发症的影响。本文研究的主要内容有:
　　 (1)山茱萸活性部位的筛选与纯化
　　 采用溶剂梯度萃取及D101大孔树脂分离，将山茱萸85％的乙醇回流提取物，划分为多个活性组分，得到山茱萸总浸膏，石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水部位，得到不同极性的山茱萸提取物。结合HepG2细胞消耗葡萄糖糖和活性氧抑制实验结果，初步筛选出乙酸乙酯萃取物（成分分析主要含有五环三萜类）和正丁醇萃取物（主要含有环烯醚萜及其苷类）。正丁醇部位经过D101大孔树脂进一步分离后，环烯醚萜及苷类在30％乙醇洗脱液中有效富集。将乙酸乙酯部位、正丁醇-D101大孔树脂30％洗脱部位经硅胶柱层析、葡聚糖凝胶SephadexLH-20柱层析后，得到熊果酸、马钱苷、莫诺苷三个化合物。
　　 (2)山茱萸体外降糖实验
　　 以HepG2细胞实验α-葡萄糖苷酶实验和作为评价降糖效果的依据。山茱萸乙酸乙酯和正丁醇部位有较高的促进细胞消耗葡萄糖的活性，而正丁醇-D101大孔树脂-30％乙醇洗脱组分具有更强的促进细胞消耗葡萄糖的活性。最终分离纯化得到的单体化合物熊果酸、马钱苷及莫诺苷具有最高的促进细胞消耗葡萄糖的能力，由强到弱顺序为马钱苷，莫诺苷，熊果酸。山茱萸各活性组分及活性成分对α-葡萄糖苷酶活性没有显著的抑制活性。其乙酸乙酯部位、正丁醇-D101大孔树脂30％洗脱部位IC5o分别为2.40mg/ml和4.24mg/ml，化合物马钱苷、莫诺苷和熊果酸无明显的α-葡萄糖苷酶抑制活性。
　　 (3)山茱萸体外抗氧化实验
　　 以高糖环境下HepG2细胞作为研究山茱萸体外抗氧化的模型，实验结果显示，乙酸乙酯部位具有较高的抑制氧化应激的能力，减少细胞ROS的生成，其次为正丁醇-D101大孔树脂30％洗脱部位。在3个化合物中，熊果酸活性最高，马钱苷、莫诺苷两种成分也具有一定抗氧化活性。
　　 (4)山茱萸对STZ诱导糖尿病小鼠模型各生理指标的影响
　　 在STZ诱导糖尿病小鼠长期试验中，研究发现山茱萸各活性组分及成分对糖尿病小鼠的的饮食、饮水、体重、肾体比和血液中SOD、MDA、AR活力或含量都存有积极的影响。实验结果显示，对糖尿病及其并发症治疗效果病活性最高的组分为乙酸乙酯部位;熊果酸能显著提高糖尿病小鼠血浆内SOD活性，降低MDA含量，抑制AR酶活性，延缓STZ诱导糖尿病小鼠肾脏的肿大，其次为马钱苷，莫诺苷。同时还发现熊果酸与马钱苷联合使用的治疗效果最佳。

目录

声明

摘要

第1章 文献综述

1．1 前言

1．2 糖尿病及其并发症的认识与现状

1．3 糖尿病及其并发症的发病机理

1．3．1 糖尿病发病机理

1．3．2 氧化应激与糖尿病并发症发病机理

1．4 糖尿病及其并发症的药物治疗

1．4．1 糖尿病的药物治疗

1．4．2 糖尿病并发症药物治疗

1．4．3 中药治疗糖尿病及其并发症

1．5 山茱萸研究进展

1．5．1 山茱萸的化学成分

1．5．2 山莱萸的药理作用

第2章 引言

2．1 研究目的和意义

2．2 研究内容

第3章 山茱萸活性组分的制备及对HepG2细胞摄取葡萄糖的影响

3．1 山茱萸中活性组分及成分的制备

3．1．1 实验材料

3．1．2 溶液配制

3．1．3 HepG2细胞培养

3．1．4 HepG2细胞初筛山茱萸降糖及抗氧化组分

3．1．5 山茱萸活性组分的提取与分离

3．1．6 实验结果

第4章 山茱萸活性组分的体外降糖活性研究

4．1 实验材料

4．1．1 试剂及材料

4．1．2 主要实验仪器

4．2 实验方法

4．2．1 溶液配制

4．2．2 α-葡萄糖苷酶活性抑制实验

4．2．3 HepG2细胞葡萄糖消耗实验

4．2．4 统计方法

4．3 实验结果

4．3．1 山茱萸活性组分及成分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ对α-葡萄糖苷酶的抑制活性

4．3．2 山茱萸活性成分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ促进HepG2细胞葡萄糖消耗实验

4．4 小结与讨论

第5章 山茱萸活性组分体外抗氧化研究

5．1 实验材料

5．2 实验方法

5．3 统计方法

5．4 实验结果

5．5 小结与讨论

第6章 山茱萸对小鼠糖尿病并发症的改善

6．1 实验材料

6．2 实验方法

6．2．1 糖耐量实验

6．2．2 糖尿病动物模型建立及分组处理

6．2．3 统计分析

6．3 实验结果

6．3．1 山茱萸活性组分对正常小鼠糖耐量实验

6．3．2 山茱萸活性组分及成分对糖尿病小鼠空腹血糖值(FBG)的影响

6．3．3 山茱萸活性组分及成分对糖尿病小鼠各生理评价指标的影响

6．4 小结与讨论

第7章 总结

7．1 山茱萸活性组分筛选及分离

7．2 山茱萸体外降糖实验研究

7．3 山茱萸外抗氧化实验研究

7．4 山茱萸对小鼠糖尿病并发症的改善

参考文献

硕士研究生期间发表的学术论文

致谢

附录