鸡柔嫩艾美耳球虫RC株表面抗原SAG17、SAG18和未知蛋白HP基因的克隆与原核表达

摘要

鸡球虫病是由属于顶复门、孢子虫纲、球虫亚纲、真球虫目、艾美耳亚目、艾美耳科、艾美耳属的原虫一种或几种寄生于鸡的肠道引起的疾病，其中柔嫩艾美耳球虫为最常见和重要的虫种。球虫病是现代养鸡业中常见的重要疾病，尤其是在现代化的集约化养鸡场，具有传播快、不容易根除的特点。柔嫩艾美耳球虫主要感染雏鸡，引起雏鸡大量死亡，而耐过的鸡只出现发育缓慢、增重率降低，母鸡产蛋量减少等影响生产效率的问题。该病的预防目前主要是靠化学药物和活疫苗。由于抗球虫药物的长期使用，造成了耐药性的产生，加之药物残留问题，使得抗球虫药物的使用受到较大的限制。但是活疫苗存在安全问题，会发生毒力返强而爆发球虫病，从而影响活疫苗的使用。基因工程疫苗是最有前途的、安全的疫苗，但是要研发艾美耳球虫基因工程疫苗，首先必须找到切实有效的保护性抗原。表面抗原在原生寄生虫的致病性发挥重要作用，其中一些具有潜在的候选疫苗或药物靶位点，很多研究表明具有免疫保护作用的基因主要是艾美耳球虫子孢子和裂殖子表面抗原和细胞器抗原。
　　 鸡柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子是球虫内生性抗原最多的阶段，对裂殖子阶段表面抗原的详细研究有助于球虫在宿主内主要生物进程蛋白识别，包括宿主入侵、复制、致病性以及宿主免疫的激发。E.Tabarés研究发现E.tenella裂殖子表面抗原是GPI锚定表面蛋白，在N-端有疏水信号肽，C-端是疏水的GPI信号锚肽，该信号肽是大约有6个半胱氨酸残基的保守的跨膜区域。但裂殖子阶段表达的各种的表面抗原在致病性和激发宿主免疫反应方面的详细作用还不清楚。因此本研究对第二代裂殖子表面抗原SAG17、SAG18和一个未知抗原蛋白HP进行基因克隆生物信息学分析以及原核表达，为其免疫原性及其他生物学功能奠定基础，也为以后柔嫩艾美耳球虫的基因工程疫苗研究提供理论依据。主要研究内容包括:
　　 表达载体是蛋白质表达研究的重要工具，本课题研究首先在PCDNA3.1的基础上，通过去除BglⅡ、SV40、Neomycin序列，添加KOZAK序列、起始密码子ATG、多克隆位点和6-His标签，构建了原、真核双表达载体pELI3.3，该载体不但可以用于本研究的原核表达，还可以在后续研究中用于柔嫩艾美耳球虫的抗原组分析和表达文库免疫(ELI)筛选。
　　 根据E.tenella豪顿株的SAG17、SAG18、HP基因序列设计引物，纯化Etenella荣昌株第二代裂殖子，提取总RNA，然后RT-PCR扩增出SAG17、SAG18和HP基因，进行TA克隆、测序。序列分析结果表明，SAG17、SAG18和HP基因与豪顿株相应基因的核苷酸序列同源性均为99％以上，推导的氨基酸序列同源性也在94以上％，说明SAG17、SAG18、HP基因在不同地理株之间保守性很高。
　　 分别将SAG17、SAG18和HP基因的TA克隆重组质粒，经过BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，然后与同样经过BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切的表达载体pELI3.3连接转化到BL21感受态细胞内，用IPTG诱导表达，使其在BL21细菌中表达。 SDS-PAGE电泳结果表明，SAG17、SAG18和HP基因表达的蛋白条带分别在29.0kDa、29.0kDa、20.1kDa附近，与理论值27.76kDa、27.09kDa、19.3kDa相符，说明这三个基因在大肠杆菌中成功表达。用Glyko Bandcan软件对凝胶扫描分析三个基因表达量分别为28％、21％、27％，最佳表达时间分别为10h、11h、11h;最佳IPTG浓度均为1mM。蛋白可溶性鉴定均为不可溶的包涵体蛋白。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 鸡球虫病概述

1．2 鸡球虫生活史

1．3 球虫防治的研究概况

1．4 艾美耳球虫抗原研究进展

1．5 展望

第二章 前言

第三章 材料与方法

3．1 材料

3．1．1 试验动物

3．1．2 质粒载体和受体菌种

3．1．3 主要试剂

3．1．4 主要试剂的配制

3．1．5 主要实验仪器

3．2 方法

3．2．1 原、真核双表达载体pELI3．3的构建

3．2．2 SAG17、SAG18和HP的克隆

3．2．3 基因序列分析

3．2．4 SAG17、SAG18和HP的原核表达

第四章 结果与分析

4．1 表达载体pELI3．3构建

4．1．1 pELI3．1的构建

4．1．2 pELI3．2构建

4．1．3 pELI3．3构建

4．2 SAG17、SAG18和HP基因克隆和序列分析

4．2．1 SAG17、SAG18、HP的RT—PCR扩增

4．2．2 TA克隆

4．2．3 SAG17基因序列分析

4．2．4 SAG18基因序列分析

4．2．5 HP基因序列分析

4．3 SAG17、SAG18和HP基因的原核表达

4．3．1 SAG17、SAG18和HP基因的亚克隆

4．3．2 诱导表达时间的优化

4．3．3 诱导表达浓度优化

4．3．4 重组表达蛋白可溶性鉴定

第五章 讨论

5．1 表达载体pELI3．3构建

5．2 SAG17、SAG18、HP基因克隆与序列分析

5．3 SAG17、SAG18和HP的原核表达

第六章 结论

参考文献

附录

致谢

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