柔嫩艾美耳球虫表面抗原基因sag13和sag14的克隆与原核表达研究

摘要

由艾美耳属球虫引发的鸡球虫病是严重危害养禽业的一种寄生虫病，长期以来的化学药物防治使球虫不断产生了抗药性，同时引发了动物源性食品的药物残留问题。采用强毒活苗和致弱疫苗接种预防鸡球虫病不失为一种手段。但由于活苗安全性较差、有效储存期短、不利于大规模生产等问题，促使人们开始研制新型疫苗——基因工程苗和/或核酸疫苗。因其可诱导产生较强的免疫保护反应等优点而倍受青睐。目前的研究焦点多集中在球虫入侵相关蛋白上，主要包括表面抗原以及各类微线体、棒状体、折射体等分泌型亚细胞器抗原，其中柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)表面锚定(GPI)抗原SAG13、SAG14在子孢子和裂殖子阶段均有表达。但有关表面抗原的生物学性质仍不很清楚。本试验克隆出抗原基因sag13，sag14，并在原核中得以表达，为今后基因工程疫苗的研究提供了一定的基础。 (1)基因sag13，sag14序列的克隆与序列分析根据GenBank已报道的E.tenella表面抗原sag13、sag14基因序列设计特异性引物，用RT-PCR方法克隆了不含N端疏水信号肽序列的柔嫩艾美耳球虫sag13、sag14基因的编码序列。构建重组质粒pGEM-sag13、pMDl9-sag14，分别转入感受态细胞Top10后测序鉴定。经DNAman软件分析测序结果，sag13全编码序列为732bp与GenBank中核苷酸序列同源率为100％；sag14全编码序列为738bp与GenBank中核苷酸序列同源率为100％，并应用SOPMA分析软件对SAG13、SAG14的一、二级结构分别进行了预测。 (2)原核表达载体pET30-sag13、pET30-sag14的构建与表达将克隆的球虫抗原基因sag13、sag14分别连入表达载体pET-30a(+)上构建重组子，将重组子pET30-sag13、pET30-sag14转入E.coli感受态细胞BL21-Gold(DE3)中，经Bandscan软件分析SDS-PAGE图得出两个外源蛋白分子量大小约为33.5kD、36kD，其分子量接近理论值(31.2kD、31.4kD)，利用镍柱层析获得的高纯度蛋白进行Westernblot鉴定，证实了外源蛋白在宿主菌中得到表达。通过改变培养条件，提高可溶性重组蛋白表达水平，在30℃条件下培养，0.4mmol/LIPTG诱导2h后收获菌体，此时融合蛋白SAG13的可溶性蛋白表达效率最高为56.5％；当30℃条件下培养，1mmol/LIPTG诱导4h后收获菌体，此时融合蛋白SAG14的可溶性蛋白表达效率最高为66.7％。在一定程度上有效的提高了可溶性外源蛋白表达量。

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第一章 绪论

1.1鸡球虫的生物学特征

1.1.1鸡球虫病病原体种类及生物学特点

1.1.2鸡球虫的生活史

1.1.3鸡球虫病的诊断

1.2鸡球虫免疫原性研究进展

1.2.1阶段性抗原的表达

1.2.2虫体表面抗原的研究

1.3球虫感染的免疫学研究

1.3.1免疫的虫种特异性及免疫的消长

1.3.2细胞免疫应答

1.3.3体液免疫

1.3.4免疫调控

1.4鸡球虫疫苗研究进展

1.4.1活球虫疫苗

1.4.2分子疫苗

第二章材料与方法

2.1试验材料

2.1.1菌株与质粒

2.1.2酶和试剂

2.1.3培养基及部分溶液的配制

2.1.4主要仪器

2.2试验方法

2.2.1 E.tenella子孢子表面抗原sag13、sag14的克隆

2.2.2 DNA片段与T载体的连接

2.2.3 E.coli Top10感受态细胞制备及转化方法

2.2.4筛选阳性重组子

2.2.5原核表达载体的构建与转化

2.2.6重组蛋白的诱导表达

2.2.7表达产物的鉴定

2.2.8不同诱导条件下的蛋白表达

第三章结果与分析

3.1表面抗原基因sag13、sag14的克隆及序列分析

3.1.1 Eimeria tenella子孢子总RNA提取

3.1.2表面抗原基因sag13和sag14编码序列的克隆

3.2重组子的鉴定

3.2.1转化菌落的PCR鉴定

3.2.2重组质粒pGEM-sag13和pMD19-sag14的酶切鉴定

3.2.3核苷酸序列测定及同源性分析

3.3重组表达载体的构建与验证

3.3.1重组表达载体pET30a-sag13的构建与验证

3.3.2重组表达载体pET30a-sag14的构建与验证

3.4重组大肠杆菌的诱导表达

3.4.1 pET30a-sag13重组大肠杆菌的诱导表达

3.4.2 pET30a-sag14重组大肠杆菌的诱导表达

3.5 SAG13、SAG14融合蛋白的Western Blot

3.6融合蛋白SAG13表达条件的优化及其量化分析

3.6.1温度对蛋白表达的影响

3.6.2 IPTG浓度对蛋白表达的影响

3.6.3 Bradford法定量融合蛋白SAG13

3.7融合蛋白SAG14表达条件的优化及其量化分析

3.7.1温度对蛋白表达的影响

3.7.2 IPTG浓度对蛋白表达的影响

3.7.3 Bradford法定量融合蛋白SAG14

第四章讨论

第五章结论

参考文献

致谢

作者简历

附录