家蚕丝氨酸蛋白酶BmSP125在表皮发育过程中的功能研究

摘要

丝氨酸蛋白酶(SP)是一个大的蛋白酶家族，占整个蛋白水解酶类的1/3，主要参与蛋白质的降解和合成，是生物体维持正常生命活动不可缺少的酶类，通过丝氨酸蛋白酶抑制剂调节其活性，从而维持昆虫体内环境的稳态。丝氨酸蛋白酶依赖于活性中心Ser、His和Asp形成的催化三联体来水解蛋白质。根据活性位点的完整性，丝氨酸蛋白酶分为活性位点完整的丝氨酸蛋白酶和活性位点不完整的丝氨酸蛋白酶同源物。丝氨酸蛋白酶种类丰富，根据靶标基团的不同，可将其分为胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶等主要类型。丝氨酸蛋白酶一般以酶原的形式合成，随着N端被水解切割而激活。在哺乳动物中，丝氨酸蛋白酶在消化、凝血和补体反应等生理过程中扮演着很重要的角色，而且在昆虫中，丝氨酸蛋白酶不仅参与昆虫的消化代谢，在昆虫的免疫防御和生长发育等过程中也起着重要的作用。在昆虫的免疫系统中和胚胎发育中，含clip结构域的丝氨酸蛋白酶主要参与外源信号的调制和扩大。同时在昆虫特有的丝氨酸蛋白酶激活系统中，根据clip丝氨酸蛋白酶在激活路径中的位置，可分为终端酶和次终端酶。
　　 本实验室在先前的研究中已鉴定出18个家蚕clip丝氨酸蛋白酶，本研究在此基础上，选取其中的clip丝氨酸蛋白酶BmSP125基因作为研究对象，对其进行序列分析和表达特征分析;利用原核表达获得重组蛋白制备了BmSP125多克隆抗体，然后用BmSP125多克隆抗体检测其在家蚕体内的合成;最后利用毕赤酵母表达系统获得有生物学活性的重组蛋白质，分析探索BmSP125在表皮发育过程中的功能。主要研究结果如下:
　　 1.家蚕丝氨酸蛋白酶BmSP125的序列分析和表达特征分析
　　 基于NCBI和家蚕基因组数据库silkDB，辅以在线软件，我们对BmSP125基因进行了生物信息学分析，发现该基因全长1173bp，包括4个外显子和3个内含子，编码390个氨基酸，其中1-19位氨基酸为信号肽序列，预测切除信号肽后的蛋白质的分子量为40.5kDa，等电点为6.5，激活位点为精氨酸(R)。序列同源性分析结果表明，家蚕(Bombyxmori)BmSP125与美国白蛾(Hyphantriacunea)凝血蛋白HcCLP2，烟草天蛾(Manducasexta)血淋巴蛋白MsHP17氨基酸序列相似度分别为71％和68％，推测它们可能具有相似的功能。
　　 借助于家蚕组织芯片数据库，我们对BmSP125基因在5龄第3家蚕各组织中的表达情况进行了调查，发现该基因在5龄第3天的头中表达量最高，体壁次之，而在其他组织中表达量很低或基本上不表达。另外，从蚁蚕到化蛾的时期表达谱发现，BmSP125基因在幼虫蜕皮后第一天表达量最高，在眠期表达量最低，在蛹期表达量逐渐升高。
　　 2.家蚕丝氨酸蛋白酶BmSP125基因的原核表达和抗体制备
　　 基于家蚕基因组精细图序列数据和BmSP12的预测基因序列，我们设计了BmSP125基因特异引物进行克隆和原核表达。构建表达载体p28-BmSP125，转化入大肠杆菌细胞，在不同的条件下进行诱导表达，获得包涵体形式的重组蛋白，并对重组蛋白进行纯化，制备了其多克隆抗体。Westernblot结果显示抗体与抗原能特异性结合。
　　 3.家蚕丝氨酸蛋白酶BmSP125的蛋白合成模式和组织定位
　　 利用BmSP125的多克隆抗体，取家蚕4龄第1天、将眠、眠24h和化蛹第1天至化蛹第9天的表皮进行Westernblot分析，发现BmSP125在表皮中有三种形式，分别为复合体、前体和成熟体。取4龄眠和5龄起的家蚕体壁进行BmSP125的免疫荧光定位，结果显示BmSP125定位在新皮和旧皮中，进一步表明BmSP125与家蚕表皮的发育有关。
　　 4.家蚕丝氨酸蛋白酶BmSP125的活性分析和功能初探
　　 利用毕赤酵母真核表达系统来表达BmSP125的成熟体，在甲醇诱导24h、48h、96h后的酵母培养基中均有重组蛋白表达。利用硫酸铵沉淀和阴离子交换柱过滤层析对重组蛋白进行纯化。BmSP125成熟体重组蛋白能使蛋白水解酶广谱底物酪蛋白水解，表明BmSP125具有蛋白水解酶活性。BmSP125成熟体重组蛋白能加速血液黑化，并且注入家蚕蛹体内后能引起表皮黑化，表明BmSP125参与家蚕体壁的黑化反应。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 昆虫体壁概述

1．1．1 昆虫体壁生长

1．1．2 昆虫体壁暗化和硬化

1．1．3 昆虫酚氧化酶在体壁暗化和硬化过程中的作用

1．2 丝氨酸蛋白酶概述

1．2．1 丝氨酸蛋白酶在昆虫体壁中的作用

1．2．2 丝氨酸蛋白酶在免疫反应中的作用

1．2．3 丝氨酸蛋白酶在信号调控中的作用

1．2．4 clip丝氨酸蛋白酶

1．3 家蚕丝氨酸蛋白酶的研究进展

第二章 引言

2．1 研究背景和目的

2．2 研究内容

2．3 研究路线

第三章 家蚕丝氨酸蛋白酶BmSP125的生物信息和表达特征分析

3．1 材料与方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验仪器与试剂

3．1．3 实验方法

3．2 结果与分析

3．2．1 BmSP125的信息分析

3．2．2 BmSP125的RT-PCR检测

3．3 讨论

第四章 家蚕丝氨酸蛋白酶BmSP125的原核表达和抗体制备

4．1 材料与方法

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验仪器与试剂

4．1．3 实验方法

4．2 结果与分析

4．2．1 BmSP125基因的克隆

4．2．2 重组表达载体的构建

4．2．3 BmSP125的原核表达结果检测

4．2．4 BmSP125重组蛋白纯化

4．2．5 BmSP125多克隆抗体特异性检测

4．3 讨论

第五章 家蚕丝氨酸蛋白酶BmSP125的蛋白分布和组织定位

5．1 材料与方法

5．1．1 实验材料

5．1．2 实验仪器与试剂

5．1．3 实验方法

5．2 实验结果

5．2．1 BmSP125的Western blot检测

5．2．1 BmSP125在家蚕体壁中的免疫荧光定位

5．3 讨论

第六章 家蚕丝氨酸蛋白酶BmSP125的活性分析和功能初探

6．1 材料与方法

6．1．1 实验材料

6．1．2 实验仪器与试剂

6．1．3 实验方法

6．2 结果与分析

6．2．1 BmSP125在毕赤酵母中的表达

6．2．2 BmSP125真核表达重组蛋白纯化

6．2．3 BmSP125的功能分析

6．3 讨论

第七章 综合与结论

参考文献

发表的论文和参与的课题研究

致谢