家蚕表皮蛋白基因的表达谱分析及表皮蛋白BmorCPT1的功能研究

摘要

昆虫表皮是生物界最坚固的结构之一，是昆虫适应复杂外界环境的重要保护器官。外骨骼的主要成分是表皮蛋白和几丁质组成，因此表皮蛋白是昆虫重要的结构蛋白。蜕皮激素和保幼激素的节律性变化调控昆虫的生长发育和蜕皮变态，而在昆虫蜕皮变态过程中表皮是变化最明显的器官。作为表皮重要组分的表皮蛋白的编码基因必然受到了激素的严格调控，因此表皮蛋白基因是研究昆虫激素调控的理想靶标。然而，激素对表皮蛋白基因的表达调控仍所知有限。而目前表皮蛋白基因表达谱数据的缺乏是认识这一科学问题的主要障碍。多个昆虫基因组数据的解析表明，表皮蛋白基因构成了一个庞大的基因家族。家蚕利用多于1％的基因组编码了超过200个表皮蛋白基因，目前的研究主要集中昆虫激素及调控的转录因子对它们的调控，包括调控表皮蛋白基因的转录因子的鉴定及分析，而关于表皮蛋白的功能知之甚少。
　　 昆虫依靠先天性免疫系统应对外界微生物的侵染。主要依赖于体内的模式识别蛋白区别“自己”和“非己”，同时这些识别蛋白也是激活昆虫体内免疫反应的最重要的分子。不同的识别蛋白能够识别并结合不同种类的微生物。前人的研究已经在昆虫中鉴定到了多个模式识别蛋白和微生物结合蛋白，这些蛋白质主要包括肽聚糖识别蛋白PGRP、葡聚糖识别蛋白GNBP/βGRP、LPS结合蛋白以及凝集素分子等等，除此之外尚未鉴定到能够结合微生物并同时能够激活昆虫免疫反应的其他蛋白质。昆虫的先天性免疫是一种全身性反应，当受到外界微生物侵染时，其体内的体液免疫反应迅速激活，启动TOLL和IMD途经和酚氧化酶级联反应产生抗菌肽和激活血液黑化反应;同时昆虫的血细胞通过吞噬、集结和形成包囊的形式参与微生物的杀灭和清除。果蝇中的研究表明革兰氏阳性细菌引起的TOLL途经的激活需要PGRP-SA、PGRP-SD与GNBP1等至少三种蛋白的共同参与，表明微生物的识别过程是由多种识别蛋白共同参与的复杂过程，这一模式在其他的昆虫中可能同样存在。
　　 家蚕的基因组在鳞翅目昆虫中得到了最为详尽的研究，其基因组和EST序列较为完善，并建立了全基因组基因芯片平台，这为家蚕表皮蛋白基因的鉴定及表达谱的分析提供了可能。与果蝇相比，家蚕的先天性免疫的研究较为落后，其原因在于相关的基础研究较为薄弱，缺乏基因功能研究对应的突变体。然而，家蚕的优势在于其体型较大，易于获得更多的体液和参与免疫反应的组织样本。本研究利用生物信息学的方法鉴定了家蚕基因组编码的表皮蛋白基因，并利用基因芯片的方法研究了家蚕表皮蛋白基因的时期表达谱;同时对家蚕的Tweedle表皮蛋白家族进行了生物信息学分析和表达模式的研究。另外，采用荧光素酶报告系统、Northernblot、Westernblot、染色质免疫共沉、免疫荧光、免疫共沉淀、LC-MS/MS以及piggyBac转座子介导的转基因等技术方法对BmorCPT1基因的表达调控和功能进行了探讨。获得的主要结果如下:
　　 1.家蚕表皮蛋白基因的表达谱研究
　　 通过生物信息学的方法，在家蚕基因组中鉴定到255个表皮蛋白基因，其中包括151个CPR基因、5个CPF/CPFL基因、4个Tweedle基因、51个CPG基因以及44个CPH基因。并对11种已经完成基因组测序的昆虫的表皮蛋白基因的数目进行了比较，发现双翅目昆虫中表皮蛋白基因较其他昆虫更多，鳞翅目昆虫基因数目处于中间水平。
　　 利用家蚕全基因组芯片的23134个探针研究了家蚕表皮组织的表达谱，在11个发育时期内共检测6676个基因的表达。等级聚类的结果表明，11个时期明显聚类为两群，第一群的时间点主要处于家蚕食桑期，第二群则主要在家蚕蜕皮期。K-means聚类显示表皮组织表达的6676个基因具有3种不同的表达模式，分别含有2450，1853和2373个基因。GO分类的结果显示，3种表达模式的基因在功能分类上具有明显的差异。这些结果表明，家蚕在食桑期与没有进食的眠期，表皮组织基因的表达具有明显不同。进一步筛查了4龄眠期对比4龄4天、上蔟3天对比上蔟2天共同上调和下调表达大于或等于4倍的基因，共鉴定到94个上调表达和2个下调表达的基因。
　　 家蚕基因组中共鉴定得到255个表皮蛋白基因，其中249个基因具有对应的寡聚核苷酸探针。其中，227(93％)个探针检测到表达信号。3对表皮蛋白基因由于核苷酸序列高度相似，因此无法设计单个基因特异的探针;6个基因无法设计合适的探针，但是获得了其EST数据。进一步采用Northemblot检验了基因芯片结果的可信度。通过聚类分析，选择的16个发育时期聚类为两群，其中第一群主要是生长期，第二群则主要包括幼虫眠期和蛹期末期，且两群的基因表达模式差异较大。表明家蚕表皮蛋白基因的表达受到自身发育状态的影响较大，暗示激素调控家蚕表皮蛋白基因。K-means聚类分析的结果表明，家蚕表皮蛋白基因能够分为5类不同的表达模式，分别标注为A-E组，其中A组的表皮蛋白基因在几乎所有的16个发育时期均有高水平的表达;B和C组的基因主要是在幼虫蜕皮期、预蛹末期以及蛹末期具有较高水平的表达;D组的基因代表了主要在蛹期高表达的表皮蛋白基因;E组的基因的表达模式则比较杂乱。另外，分析发现B组的基因在蛹期比C组具有更高水平的表达信号。分析表明表皮蛋白基因的表达模式与保守的氨基酸基序之间没有必然的联系。B、C组包括101个表皮蛋白基因中，有49个分布于22号染色体上，而这些基因均属于CPR基因家族。表明家蚕的表皮蛋白基因在染色体上的分布并不是随机分布的，而是具有相对集中的分布特点。进一步分析22号染色体上的49个基因，发现其中26在幼虫期至预蛹期具有一致的表达模式，并在其基因的启动子区域鉴定到了3个共有的保守元件，推测其可能具有协同表达的模式。
　　 2.家蚕中含有Tweedle基序的表皮蛋白基因生物信息学分析及表达谱研究
　　 通过11种昆虫的比较，发现Tweedle基因的数目在不同昆虫中差异较大，最多的黑腹果蝇具有27个，最少的蚜虫只有3个，4种鳞翅目昆虫中均只含有4个Tweedle基因。家蚕的4个Tweedle基因分别命名为BmorCPT1-4。通过对11种昆虫的81条Tweedle基因的氨基酸序列分析表明，不同昆虫的Tweedle基因的氨基酸序列分化较大，然而在Tweedle基序的某些位点上是保守的，将Tweedle基序的4个BLOCK概括为:KxxY/F、YK/RxxxFKAP、KTxxYVL、KPEVY/FFxKY，其中x为V、I、L等疏水性的氨基酸。系统发生分析的结果表明鳞翅目昆虫的Tweedle基序更为保守;来自黑腹果蝇的14个Tweedle基因与其他的基因分离而单独聚为一支，支持了基因加倍的观点。
　　 6种鳞翅目昆虫的25个Tweedle基因的氨基酸序列分析和系统发生分析表明，BmorCPT1的同源基因与其他具有较大的分化。BmorCPT1直向同源基因的结构分析表明它们在核苷酸水平上差异较大;通过氨基酸序列的分析，在BmorCPT1蛋白质羧基端鉴定到一个新的保守基序，包括18个氨基酸残基。随后的分析表明这一基序只存在于鳞翅目昆虫的BmorCPT1同源蛋白质的羧基端，遂将其命名为LSM(LepidopteraSpecificMotif)。
　　 利用RT-PCR的方法研究了家蚕Tweedle基因组织和时期表达谱。BmorCPT1基因主要在表皮、精巢和头部高量表达，在气管和脂肪体有微弱的表达信号。BmorCPT2基因只在精巢和头部检测到微弱的表达信号。BmorCPT3基因在10个组织中均不表达。BmorCPT4基因在气管、精巢、马氏管、中肠微量表达。在胚胎期，BmorCPT1基因在96小时表达水平较高;BmorCPT2和BmorCPT3基因在产卵后96和120小时表达;BmorCPT4基因在产卵后120小时有高量的表达。在家蚕胚胎后期，BmorCPT1基因的与其他的3个Tweedle基因的表达谱具有明显的差异，由RT-PCR的结果可以看出，除了3龄眠期、4龄眠期、蛹期4天至蛹6天微量表达，BmorCPT1基因在家蚕的绝大部分发育时期均有较高水平的表达。此外，BmorCPT1基因的表达还具有一个特点，在幼虫期的前期均有较高水平的表达，而在该龄期末则表达水平较低，这一趋势在3龄至5龄期的幼虫表现尤为明显。与BmorCPT1基因的表达模式不同，BmorCPT2～4基因的表达高峰则几乎都出现在幼虫期每个龄期的眠期、预蛹期末以及蛹期的中后期，而其他时期表达水平极低或者没有信号。BmorCPT1与其它的Tweedle基因时空表达谱差异较大，暗示它们可能分别承担了不同的功能。
　　 3.BmorCPT1的表达调控与功能研究
　　 克隆了BmorCPT1基因上游2002bp(-1992bp至+10区域，翻译起始位点为+1)区域，并在其-1442bp的位置鉴定到一个NF-κB因子的结合位点。构建了基于pGL3-basic质粒的转染载体，通过荧光素酶报告实验和Westernblot（使用荧光素酶抗体）证明BmorCPT1的启动子能够被LPS（脂多糖）激活，这种效应能够被NF-κB信号的专一性抑制剂PDTC抑制，染色质免疫共沉淀实验表明NF-KB因子能够结合在BmorCPT1基因的NF-κB结合位点上，证明LPS对BmorCPT1基因的激活是由NF-κB信号介导的。荧光素酶报告实验和Westernblot保幼激素类似物JHA（苯氧威）激活BmorCPT1的启动子，而蜕皮激素类似物EA（虫酰肼）对其没有作用。进一步分析表明，LPS的激活作用能够被JHA和EA抑制;通过检测NF-κB信号途经上游的激酶IKKα/β的磷酸化水平，发现JHA不影响IKKα/β的磷酸化，而加入EA则导致IKKα/β磷酸化水平降低，表明两种昆虫激素对其抑制作用的位置是不同的。所有荧光素酶报告实验的结果经过T-检验分析具有显著性差异。
　　 将去除信号肽的BmorCPT1基因的克隆到pET-28(a)载体上，将构建的重组质粒转到BL21表达菌株，通过IPTG诱导了BmorCPT1重组蛋白的表达。表达的重组蛋白存在于包涵体中，利用8M尿素溶解包涵体，通过组氨酸亲和柱纯化和超滤浓缩，并经过银染检测，获得的纯化蛋白与目的蛋白分子量一致，表明重组蛋白己被纯化，可用于免疫新西兰公兔，制备抗体。通过检测获得抗体的效价达到1:32000。
　　 利用Westernblot分析了BmorCPT1蛋白在家蚕5龄3天组织中的表达，其中在表皮和头部高量表达，在气管中和脂肪体低量表达。进一步检测了BmorCPT1蛋白在不同发育时期表皮组织中的分布，发现在家蚕4龄2天和3天表达量较高，进入4龄眠期过程中，表达水平明显下降;而在家蚕进入5龄后，BmorCPT1蛋白的水平剧烈上升，并在5龄2天至5龄6天，逐渐下降。另外，在上蔟2天和3天的预蛹期表达水平较高，在进入蛹期的过程中呈现出一种先下降而后迅速上升的趋势，并保持较高的水平持续到蛹期第6天;在蛹期7天和8天以及成虫表皮中没有检测到BmorCPT1蛋白质。在5龄期表皮中的BmorCPT1蛋白质的表达量随着其体重和体积不断增大的同时反而不断下降，表明BmorCPT1的表达量与家蚕的体形变化呈负相关。
　　 微生物诱导实验的结果表明，BmorCPT1蛋白仅在微生物诱导后的家蚕血浆中被检测到。在注射球孢白僵菌和黑胸败血菌的家蚕血浆中3、6和12小时有较低水平的表达;而在注射大肠杆菌6～24小时，则具有明显的上升的趋势，在注射24小时之后，信号达到峰值，这一趋势与某些已知的免疫相关的蛋白相类似，表明BmorCPT1基因对于大肠杆菌的侵染较球孢白僵菌和黑胸败血菌更加敏感。Northernblot分析显示，大肠杆菌免疫后表皮组织中BmorCPT1基因表达没有明显差异，脂肪体中具有轻微的上调，血细胞中BmorCPT1在诱导后开启表达。Westernblot分析表明，诱导前后表皮中BmorCPT1蛋白质水平没有明显差异，同时发现血浆中BmorCPT1蛋白质条带较表皮组织滞后，推测血浆中的BmorCPT1蛋白质经历了翻译后修饰。脂肪体中BmorCPT1在诱导后表达上调，只在注射大肠杆菌的家蚕血细胞中检测到BmorCPT1，而且在血细胞中检测到与血浆中一致的滞后条带，证明家蚕BmorCPT1的翻译后修饰是在血细胞中发生的。基于文献，猜测家蚕血浆中检测到的BmorCPT1可能经历了糖基化修饰，对其进行了预测，结果显示BmorCPT1氨基酸序列中不存在N-糖基化位点;预测得到18个O-糖基化的位点，这些位点集中出现在418～456位的氨基酸残基，得分最高的是434位的苏氨酸。
　　 收集大肠杆菌免疫后的家蚕血浆进行了细菌结合-免疫荧光实验，表明免疫后血浆中的BmorCPT1能够强烈地结合大肠杆菌;Westemblot实验进一步证明了这一结果。为了进一步分析BmorCPT1的功能，基于大肠杆菌免疫后的家蚕血浆，利用免疫共沉淀寻找BmorCPT1的结合蛋白，通过LC-MS/MS共鉴定到429个肽段匹配61个蛋白质，其中包括肽聚糖识别蛋白PGRP-S5和脂多糖结合蛋白LBP。通过免疫共沉淀结合Westernblot的方法证明翻译后修饰的BmorCPT1能够结合BmPGRP-S5和BmLBP。
　　 4.BmorCPT1的转基因研究
　　 构建了基于piggyBac转座子的转基因载体，piggyBac{3xP3-DsRed-pDmHSP70-BmorCPT1_ORF-SV40}，简写为PBHT。利用黑腹果蝇HSP70基因的启动子pDmHSP70驱动家蚕BmorCPT1基因的表达，以3xP3启动子驱动的红色荧光蛋白DsRed作为转基因筛选标记。最终共获得了32头G1代阳性个体，转基因阳性率为28％。通过提取转基因品系家蚕PBHT的基因组，利用反向PCR的方法确定转基因载体插入到家蚕第12号染色体上，在基因组上的位置为chr12∶6278159-6278000。
　　 选择BmorCPT1基因mRNA水平极低的4龄眠期的家蚕作为热激处理的对象，经过42℃，90分钟的热激处理，在热激后4小时和8小时，利用Northernblot在经过热激处理的转基因家蚕(PBHT-AHS)中检测到BmorCPT1基因的高量表达，对照组（未热激转基因家蚕PBHT-CON、热激非转基因家蚕WT-AHS和未热激非转基因家蚕WT-CON）中没有检测到BmorCPT1基因的mRNA。证明热激处理能够特异的激活pDmHSP70驱动BmorCPT1基因的表达。通过分析热激处理对家蚕产卵-孵化率的影响，发现4组PBHT-AHS、PBHT-CON、WT-AHS和WT-CON家蚕的发育及产卵-孵化率没有明显的差异，表明本次热激实验对于家蚕的生长发育及生理状态没有影响。
　　 通过Northernblot分析发现家蚕肽聚糖识别蛋白BmPGRP-S5和脂多糖结合蛋白BmLBP基因在热激处理后8小时的PBHT-AHS家蚕中上调表达，在三组对照组中保持本底水平表达:另外，PBHT-AHS家蚕的抗菌肽基因BmGlv1和BmGlv4在热激处理后8小时高量表达，对照组中检测不到BmGlv1和BmGlv4基因的mRNA。表明在没有任何微生物侵染的情况下，提高BmorCPT1基因的表达水平能够激活家蚕免疫相关基因的表达。BmorCPT1基因的异位表达能够激活BmPGRP-S5和BmLBP基因、IMD途经基因BmImd、BmDredd和BmRelish以及抗菌肽基因BmGlv1和BmGlv4在脂肪体中的表达。
　　 综合上文细菌结合实验和免疫共沉淀实验的结果，我们提出家蚕血细胞表达并完成翻译后修饰的BmorCPT1分泌进入血浆，能够与肽聚糖识别蛋白BmPGRP-S5和脂多糖结合蛋白BmLBP结合，共同参与识别并结合大肠杆菌，并通过家蚕IMD途经激活抗菌肽基因BmGlv1和BmGlv4的表达;家蚕利用翻译后修饰的策略，将含有Tweedle基序蛋白BmorCPT1转化成为一个模式识别受体类似的免疫分子。

目录

本研究主要由以下项目资助：

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 概述

1．2 昆虫表皮蛋白基因的调节研究

1．2．1 保幼激素和蜕皮激素控制昆虫的蜕皮和变态

1．2．2 βFTZ-F1因子

1．2．3 BR-C因子

1．2．4 其他转录因子

1．3 昆虫先天性免疫

1．3．1昆虫体液免疫途经的激活

1．3．2 昆虫细胞免疫

第二章 引言

2．1 研究背景、目的及意义

2．2 研究内容

2．3 研究路线

第三章 家蚕表皮蛋白基因表达谱研究

3．1 材料与方法

3．1．1 数据库和基因序列

3．1．2 分析工具和软件

3．1．3 实验材料

3．1．4 主要仪器和试剂

3．1．5 生物信息学分析方法

3．1．6 寡聚核苷酸芯片杂交实验

3．1．7 芯片数据的采集与处理

3．1．8 基因芯片数据的分析

3．1．9 Northern blot杂交实验

3．2 结果与分析

3．2．1 家蚕表皮蛋白基因家族及其保守结构区域的分析

3．2．2 家蚕表皮蛋白基因的表达谱分析

3．3 讨论

第四章 家蚕中含有Tweedle基序的表皮蛋白基因

4．1 材料与方法

4．1．1 数据库和基因序列

4．1．2 分析软件和网站

4．1．3 实验材料

4．1．4 实验仪器及试剂

4．1．5 实验方法及流程

4．2 结果与分析

4．2．1 Tweedle保守基序的发现

4．2．2 含有Tweedle基序的表皮蛋白在昆虫中的分布、系统发生及其氨基酸保守位点分析

4．2．3 6种鳞翅目昆虫中Tweedle基因的系统发生及其氨基酸保守位点分析

4．2．4 BmorCPT1及其直向同源基因的结构分析

4．2．5 BmorCPT1控基端的保守区域

4．2．6 只在鳞翅目中保守的LSM区域

4．2．7 家蚕中舍有Tweedle基序的表皮蛋白基因组织与时期表达分析

4．3 讨论

4．3．1 鳞翅目昆虫Tweedle基因的分化

4．3．2 鳞翅目昆虫特有的保守基序LSM

第五章 BmorCPT1的表达调控与功能研究

5．1 材料与方法

5．1．1 基因组序列

5．1．2 实验材料及细胞系

5．1．3 载体、菌株和试剂盒

5．1．4 实验仪器(见附录)、试剂及溶液

5．1．5 试验方法及流程

5．2 结果与分析

5．2．1 BmorCPT1基因上游启动子区域结合元件分析与荧光素酶报告载体的构建

5．2．2 细胞转染效率检测

5．2．3 LPS诱导细胞与ChIP-PCR

5．2．4 昆虫激素的诱导

5．2．5 LPS和激素对BmorCPT的调节作用

5．2．6 原核表达载体的构建

5．2．7 BmorCPT1的原核表达与纯化

5．2．8 BmorCPT1抗体的制备与纯化及抗体效价测定

5．2．9 BmorCPT1蛋白质的表达分析

5．2．10 微生物诱导实验

5．2．11 BmorCPT1蛋白质糖基化位点预测

5．2．12 大肠杆菌结合实验

5．2．13 免疫共沉淀(Co-IP)实验及LC-MS／MS鉴定结果

5．2．14 免疫共沉淀鉴定BmorCPT1的结合蛋白

5．3 讨论

5．3．1 BmorCPT1基因受到NF-κB和昆虫激素信号的调控

5．3．2 BmorCPT1蛋白质翻译后修饰

5．3．3 BmorCPT1结合蛋白的鉴定

第六章 BmorCPT1的转基因研究

6．1 材料与方法

6．1．1 实验材料

6．1．2 载体与菌株

6．1．3 试剂和仪器(见附表)

6．1．4 试验方法及流程

6．2 结果与分析

6．2．1 转基因载体的构建

6．2．2 筛选转基因阳性个体及结果统计

6．2．3 转基因载体在家蚕基因组中插入位点的分析

6．2．4 BmorCPT1在家蚕中的异位表达实验

6．2．5 BmorCPT1异位表达的蛋白质水平检测

6．2．6 BmorCPT1的异位表达对IMD途经基因的影响

6．2．7 热激处理对家蚕产卵-孵化率的影响

6．3 讨论

综合与结论

论文的创新点

参考文献

附录

本研究论文各章节使用的仪器耗材

在读期间发表论文及参加课题

致谢