自噬在氧化应激介导的尿蛋白所致肾小管上皮细胞损伤中的作用

摘要

目的:
　　在发现尿蛋白可诱导肾小管上皮细胞自噬泡堆积的基础上，进一步探讨氧化应激在尿蛋白所致TECs细胞自噬泡堆积及细胞损伤中的作用及其机制，为尿蛋白所致慢性肾脏病的防治寻找新的靶点。
　　方法:
　　1.应用硫酸铵沉淀法提取轻微病变型肾病综合征患者尿液中的总蛋白成分。
　　2.应用不同浓度的尿蛋白(0 mg/ml、1.0 mg/ml、2.0 mg/ml、4.0 mg/ml、8.0mg/ml)处理体外培养的HK-2细胞，运用流式细胞术检测HK-2细胞ROS的荧光强度，明确尿蛋白诱导HK-2细胞ROS的量效关系。
　　3.给予氧化应激抑制剂NAC预孵育细胞30min后，加入尿蛋白使其终浓度为4.0 mg/ml共同培养8h，采用Western blotting方法检测HK-2细胞自噬泡标志物LC3-Ⅱ的活化情况;采用Western blotting方法检测各组Beclin-1的表达;MTT法检测氧化应激抑制剂对尿蛋白刺激HK-2细胞后的细胞增殖率的影响;采用ELISA方法检测各组细胞培养上清液中NAGL、KIM-1的分泌水平。
　　结果:
　　1.MCG患者来源尿蛋白的主要成分为白蛋白、转铁蛋白和IgGs等，分别占88.0％、8.5％、3.3％，其它占0.2％。
　　2.ROS在MCG患者尿蛋白刺激的HK-2细胞的产生情况:①尿蛋白呈浓度依赖性升高HK-2细胞ROS荧光强度值，8 mg/ml时达到高峰，2、4和8 mg/ml组的ROS荧光强度值明显高于空白组(P＜0.05);②在8 mg/ml组，HK-2细胞ROS的荧光强度值随着尿蛋白作用时间的延长而增强，在2h达到高峰，6h后逐渐下降。
　　3.尿蛋白可诱导HK-2细胞Beclin-1和LC3-Ⅱ表达升高，氧化应激抑制剂NAC下调尿蛋白诱导的HK-2细胞自噬泡标志物LC3-Ⅱ表达和Beclin-1表达。
　　4.氧化应激抑制剂NAC可拮抗尿蛋白所致HK-2细胞增殖和NAGL、KIM-1分泌。
　　结论:
　　尿蛋白通过氧化应激导致TECs损伤，同时也可诱导TECs内自噬泡堆积，自噬在这一病理过程中起着自救作用。阻断ROS的产生，一定程度上可抑制尿蛋白诱导的HK-2细胞自噬泡堆积，可能减轻尿蛋白对HK-2细胞的损伤，有助于延缓肾间质纤维化的发生发展。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 研究背景

1．2 研究目的

1．3 研究内容

2 材料与方法

2．1 研究对象

2．2 主要实验仪器设备

2．3 主要试剂

2．4 试剂配制

2．5 实验方法

2．6 统计学分析

3 结果

4 讨论

5 小结

参考文献

致谢

活性氧及其介导的自噬

附录1 缩写词中英文对照

附录2 读研期间科研情况