柑橘果实感染脚腐病前后挥发性成份和类黄酮的变化的研究

摘要

寄生疫霉（Phytophthora parasitica）是一种危害严重柑橘叶片和果实的植物病原菌，寄主范围广泛，该真菌也是引起柑橘脚腐病的主要致病因子。高温高湿是发病的主导因素之一。根据前期黄景龙柑橘资源抗病性的鉴定试验发现酸橙类、香橙类、枳类和黎檬类多为抗病资源，甜橙类、巴柑檬类、枸橼类等为感病资源。为探究柑橘资源的抗病机制，有必要对柑橘感染该菌前后挥发物质和类黄酮等次生代谢物的变化进行深入研究。本文选取了5个品种柑橘（椪柑、脐橙、夏橙、香橼和红藜檬），基于项空固相微萃取-气相色谱-质谱联用(HS-SPME-GC-MS)和超高效液相色谱(UPLC)技术，分析了寄生疫霉病菌感染5个柑橘品种果实染病后不同部位挥发性物质和类黄酮的组成的含量和差异。主要的研究结果如下:
　　1.柑橘挥发性物质萃取条件的优化
　　采用单因素优化了HS-SPME技术萃取柑橘果肉挥发性物质的条件:在果肉样品中加入1.0g NaCl，达到盐不饱和环境;密封样品瓶恒温50℃下孵化，热平衡25min;活化好的SPME萃取纤维头插入，萃取40min;最后萃取纤维头在GC进样口解析5min，果肉中挥发性风味成分能达到最好的萃取效果。果皮的优化条件为:在果肉样品中加入1.0 g NaCl，达到盐不饱和环境;密封样品瓶恒温50℃下孵化，热平衡20min;活化好的SPME萃取纤维头插入，萃取50min;最后萃取纤维头在GC进样口解析5min，果皮中挥发性风味成分能达到最好的萃取效果。
　　2.柑橘中主要挥发性物质的定性和半定量
　　利用NIST2008和Flavour2.0图谱库，结合化合物的保留指数，对各种挥发性物质进行定性。柑橘属植物中挥发物质主要由萜烯类、醇类、醛类、酯类、酮类、芳香烃类及其它物质组成，其中主要成分有D-柠檬烯、芳樟醇、γ-萜品烯、石竹烯、橙花醛和柠檬醛等。
　　3.5个柑橘品种染病前后果肉挥发性物质的比较
　　5个柑橘品种的健康果肉共检测出了106种挥发性物质，其中红肉脐橙、沿溪晚芦椪柑、香橼、夏橙和红藜檬分别检出了34、34、38、59和44种挥发性物质，总含量分别为2586.17μgg-1、2690.49μg g-1、2442.32μg g-1、599.27μg g-1和716.26μg g-1。柑橘果肉中含量最丰富的是萜烯烃类成分，相对含量达到了85％以上，D-柠檬烯是其中含量最多的成分。其次是醇类和醛类物质。不同品种果肉挥发物质组成各具特点，物质组成存在一定差异。
　　5个柑橘品种的损伤果肉共检测出了147种挥发性物质，其中红肉脐橙、沿溪晚芦椪柑、香橼、夏橙和红藜檬别检出了55、61、65、69和57种挥发性物质，总含量分别为1777.51μgg-1、2596.64μg g-1、2389.02μg g-1、487.59μg g-1和575.14μg g-1。柑橘经过损伤后，果肉中挥发性成分发生了一定的变化，但变化规律在不同品种间表现出一定的差异。含量最多的萜烯烃类成分相对含量95％以上，D-柠檬烯是其中含量最多的成分。与其它品种相比，香橼果肉中含有更丰富的芳香烃类化合物，其代表性物质为1，6-辛二烯-3-醇，3，7-二甲基-，2-氨基苯甲酸等。
　　5个柑橘品种感染脚腐病菌后，果肉共检测出了147种挥发性物质，其中红肉脐橙、沿溪晚芦椪柑、香橼、夏橙和红藜檬别检出了65、64、57、84和64种挥发性物质，总含量分别为1283.27μg g-1、1384.27μgg-1、752.32μgg-1、402.56μ gg-1和507.54μgg-1。柑橘染病后挥发性物质含量在各个品种中分别减少了27.81％，46.69％，68.51％，17.44％和11.75％，其中香橼变化最显著，柠檬最不显著。挥发性组分中变化最明显的是萜烯类中的D-柠檬烯。在各个品种中占到了减少的比例分别为156％，93％，48％，179％和236％。
　　4.5个柑橘品种染病前后果皮挥发性物质的比较
　　5个柑橘品种的健康果皮共检测出了135种挥发性物质，较果肉丰富，其中红肉脐橙、沿溪晚芦椪柑、香橼、夏橙和红藜檬分别检出了73、63、54、47和49种挥发性物质，总含量分别为3275.82μg g-1、7302.25μg g-1、14111.10μg g-1、1852.33μg g-1和2040.02μg g-1。与其它品种相比，香橼果皮中含有更丰富的芳香族化合物，其代表性成分为2-氨基苯甲酸-3，7-二甲基-1，6-辛二烯-3-醇酯。
　　5个柑橘品种的损伤果皮共检测出了143种挥发性物质，其中红肉脐橙、沿溪晚芦椪柑、香橼、夏橙和红藜檬别检出了103、76、57、76和76种挥发性物质，总含量分别为2721.531μgg-1、6715.52μg g-1、13679.77μg g-1、1528.69μg g-1和1748.2μg g-1。柑橘损伤后，果皮中挥发性成分含量较无损伤组都有所下降。含量最多的萜烯烃类成分下降到了37％左右，D-柠檬烯仍是其主要成分。与其它品种相比，香橼果皮中仍更多的芳香组化合物，代表性物质为1，6-辛二烯-3-醇，3，7-二甲基-，2-氨基苯甲酸，与果肉中保持一致。
　　5个柑橘品种感染脚腐病菌后，果皮共检测出了204种挥发性物质，其中红肉脐橙、沿溪晚芦椪柑、香橼、夏橙和红藜檬别检出了114、75、64、70和75种挥发性物质，总含量分别为2014.55μg g-1、4992.29μg g-1、9385.86μgg-1、1799.32μg g-1和5386.32μg g-1。柑橘染病后挥发性物质含量较损伤组表现出不一致的差异，其中脐橙下降25.98％、、椪柑下降25.66％和香缘下降31.39％，夏橙增加17.7％，红藜檬增加208.09％。挥发性组分中变化最明显的是萜烯类中的D-柠檬烯，在脐橙中占挥发性成份下降比例的106％，在椪柑中占下降比例的77％，在香缘中占下降比例的54％，在夏橙中占上升比例的104％，在红藜檬中占上升比例的27％。在红藜檬中在上升比例的较高的物质还有(-)-4-萜品醇、α-松油醇、α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯和异松油烯等。
　　5.5个柑橘品种11种类黄酮含量的变化
　　染病后，脐橙、椪柑和香橼中果肉与果皮中11种类黄酮的总含量均减少，而红藜檬和夏橙则是在染病后上升，其中香橼下降的最多，而红藜檬上升的最多。在不同品种中还产生了一些新的黄酮类物质，如在香缘中检测出的新橙皮苷，在岩溪晚芦椪柑中检测出的橙皮素等。
　　本研究首次采用气质联用和超高效液相色谱技术检测不同品种柑橘感染寄生疫霉前后挥发性物质和多种类黄酮的变化，其差异变化可以为柑橘感染该种病害的检测提供一些参考。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 果实香气成分研究进展

1．2 柑桔类黄酮功能成份研究进展

1．3 分离提取方法及检测技术的研究

1．3．1 分离提取技术

1．3．2 检测技术研究

1．4 微生物病害对果实挥发性成分和类黄酮的影响

第二章 引言

第三章 材料与方法

3．1 实验材料与试剂

3．2 仪器与设备

3．2．1 香气测定仪器与设备

3．2．2 类黄酮测定仪器与设备

3．3 实验方法

3．3．1 香气样品的制备

3．3．2 样品前处理

3．3．3 香气成分测定的实验条件

3．3．4 类黄酮仪器分析条件

3．3．5 香气成分的定性与半定量

第4章 5种柑桔不同部位染病前后香气成分的分析

引言

4．1 挥发性成分HS-SPME萃取条件优化

4．1．1 平衡温度对萃取效果的影响

4．1．2 热平衡时间对萃取效果的影响

4．1．3 不同萃取时间对萃取效果的影响

4．1．4 盐效应对萃取效果的影响

4．1．5 小结

4．2 柑桔挥发性成分分析

4．2．1 健康的未打孔处理的果肉挥发性物质含量与组分的比较分析

4．2．2 健康的打孔处理的果肉挥发性物质含量与组分的比较分析

4．2．3 染病的打孔处理的果肉挥发性物质含量与组分的比较分析

4．2．4 健康的未打孔处理的果皮挥发性物质含量与组分的比较分析

4．2．5 健康的打孔处理的果皮挥发性物质含量与组分的较分析

4．2．6 染病的打孔处理的果皮挥发性物质含量与组分的比较分析

4．2．7 果肉健康未打孔处理、健康打孔处理与染病打孔处理的挥发性物质含量与组分的比较分析

4．2．8 果皮健康未打孔处理、健康打孔处理与染病打孔处理的挥发性物质含量与组分的比较分析

4．3 小结

4．4 讨论

第五章 超高效液相色谱法测定柑桔染病前后11种类黄酮物质的变化

引言

5．1 结果与分析

5．1．1 11种类黄酮的分离和鉴定

5．1．2 5个健康柑橘品种11种类黄酮的检测分析

5．1．3 5个染病柑橘品种11种类黄酮的检测分析

5．1．4 5个染病柑橘与健康柑橘类黄酮含量与组成的比较分析

5．2 小结

第六章 结论

6．1 结论

6．2 存在的问题

附表

参考文献

致谢

硕士期间发表的论文