柠檬枝枯病与柑桔脚腐病菌的PCR检测技术研究

摘要

由桔茎点霉(Phomatracheiphila)引起的柠檬枝枯病(Malsecco)是一种检疫性真菌病害，主要分布在地中海、黑海地区，对许多沿海周边国家的柑桔生产尤其是柠檬生产造成了一定的经济损失。我国尚未发现柠檬枝枯病，但随着国际贸易日益加大，其传播和扩散的风险性增大，因此许多国家及地区的植物保护组织已将该病列为检疫对象。建立准确、快速的检测技术体系用于口岸检疫，对于预防柠檬枝枯病的传入至关重要。 柑桔脚腐病(Footrotofcitrus)是由疫霉菌(Phytophthoraspp.)引起的一种真菌性病害，在世界范围内广泛分布。该病是一种土传病害，主要危害甜橙类柑桔树近地表根颈部，引起腐烂，导致树势下降。建立准确、快速的柑桔脚腐病菌检测体系，为病害的早发现、早治疗提供依据和指南，对柑桔脚腐病的防治与确保柑桔产业健康、稳步发展的意义重大。并可对该类难分离菌的种间序列比对研究提供手段，从而为其分子分类研究奠定基础。 传统的植物病原真菌诊断方法如症状观察与病原菌的分离鉴定、血清学鉴定、DNA分子杂交，存在检测灵敏度不高、潜症带菌难以检出、耗费时间等缺点。加之柑桔脚腐病存在混合侵染，即便使用选择性培养基，要从病组织或土壤中分离到每种病原物的纯培养做形态学观察也比较困难。 本实验旨在建立稳定、灵敏、快速的柠檬枝枯病和柑桔脚腐病的PCR检测技术体系，主要实验结果如下： 1.在国内首次建立了两个柠檬枝枯病的PCR检测体系，自主设计的引物对Pta-1/Pta-2和Ptb-1/Ptb-2分别扩增得到了325bp和468bp的目的条带。 2.引物Pta-1/Pta-2和Ptb-1/Ptb-2可以稳定检出致病菌桔茎点霉(P.tracheiphila)，而不能检出柑桔炭疽病、柑桔黄龙病、柑桔溃疡病、柑桔杂色褪绿病的病原及健康柑桔组织的DNA。 3.引物Pta-1/Pta-2对P.tracheiphila总核酸的检出极限浓度为10pg/μL。 4.在国内首次应用PCR检测技术对柑桔脚腐病致病菌——疫霉菌进行快速检测，扩增得到了700bp的特征性条带。 5.从中国农业科学院柑桔研究所果园内患脚腐病的柑桔树上分离获得了疫霉菌，应用巢式PCR检测技术将其鉴定为寄生疫霉，扩增得到了120bp的特征性条带。 6.采用巢式PCR技术对木质化脚腐病组织中的病原菌进行检测，先后扩增得到了700bp和120bp的特征性条带，检测出寄生疫霉。 7.对寄生疫霉和烟草黑胫病菌在rDNA的18S-ITS1-5.8S-ITS2-28S的部分序列进行比对，同源性为99％，表明二者在该区段存在高度的序列同源性，从而为寄生疫霉与烟草疫霉在种名上的合并提供了部分分子水平上的依据。

目录

文摘

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第一章文献综述

1.1柠檬枝枯病综述

1.1.1病原菌

1.1.2寄主范围及其分布

1.1.3危害及症状

1.1.4传播与流行

1.1.5致病机理研究

1.1.6防治方法

1.1.7检测方法

1.2柑桔脚腐病综述

1.2.1危害症状

1.2.2柑桔根腐病(Root rot citrus)和脚腐病的区别与联系

1.2.3柑桔脚腐病病原菌

1.2.4病原菌形态特征

1.2.5病原菌的寄主范围

1.2.6寄生疫霉与烟草疫霉之间的关系

1.2.7发病规律

1.2.8防治方法

1.2.9柑桔脚腐病菌的检测

第二章引言

第三章柠檬枝枯病的PCR检测

3.1实验材料

3.2主要化学试剂

3.3常用储备液及缓冲液

3.4主要实验仪器

3.5实验方法

3.5.1病原菌P.tracheiphila特异性引物的设计与筛选

3.5.2 PCR反应体系的初步建立

3.5.3 PCR反应体系的优化

3.5.4 PCR反应程序的优化

3.5.5 PCR扩增产物的检测

3.5.6 PCR产物序列测定

3.5.7 PCR检测体系的特异性测试

3.5.8 PCR检测体系的灵敏度

3.5.9国外已发表的PCR检测体系扩增效果

3.6结果与分析

3.6.1病原菌P.tracheiphila特异性引物的设计与筛选结果

3.6.2 PCR反应体系的初步建立

3.6.3 PCR扩增产物的测序结果

3.6.4引物Pta-1/Pta-2的退火温度梯度实验结果

3.6.5 Pta-1/Pta-2反应体系的优化

3.6.6引物Ptb-1/Ptb-2的退火温度梯度实验结果

3.6.7 Touchdown PCR实验结果

3.6.8 Ptb-1/Ptb-2反应体系的优化

3.6.9 PCR检测体系的特异性测试

3.6.10 Pta-1/Pta-2检测体系与国外已发表的柠檬枝枯病PCR检测体系灵敏度比较结果

第四章柑桔脚腐病菌的PCR检测

4.1实验材料

4.2主要化学试剂

4.3常用储备液及缓冲液

4.4主要实验仪器

4.5实验方法

4.5.1胡萝卜琼脂(CA)培养基的制备

4.5.2选择性培养基的制备

4.5.3疫霉菌的分离和纯化

4.5.4水培法诱导产生孢子囊与游动孢子

4.5.5微量快速的总核酸提取方法

4.5.6柑桔脚腐病组织DNA的提取

4.5.7疫霉菌的PCR检测

4.5.8应用巢式PCR技术对木质化带病材料的检测

4.6结果与分析

4.6.1柑桔脚腐病菌的分离培养结果

4.6.2疫霉菌的PCR检测结果

4.6.3木质化带病材料的巢式PCR检测结果

4.6.4分离菌的PCR检测结果

第五章结论与讨论

5.1结论

5.1.1柠檬枝枯病(Mal secco)PCR检测技术研究结论

5.1.2柑桔脚腐病菌PCR检测技术研究结论

5.2讨论

5.2.1柠檬枝枯病的PCR检测体系

5.2.2柑桔脚腐病菌的分离培养

5.2.3柑桔脚腐病菌PCR检测技术的灵敏度

5.2.4寄生疫霉与烟草黑胫病菌的序列比对

5.2.5有待解决的问题和需要进一步完善的工作

参考文献

附录

致谢

攻读硕士学位期间发表论文及参加科研项目