低氘水对人肝癌细胞增殖和侵袭力抑制作用及HepG2细胞miRNAs阵列分析

摘要

目的：⑴比较不同氘体积浓度对人肝癌细胞株及正常肝细胞的增殖及侵袭力的影响作用。⑵以HepG2细胞为代表，检测与分析低氘水对HepG2处理后的miRNAs差异表达谱，初步探讨低氘水抗肝癌的可能机制。
　　 方法：①MTT法检测低氘水对肝癌HepG2、7402、SK-Hep-1和正常人肝细胞LO2增值的抑制作用;平板克隆比较不同浓度低氘水作用肝癌HepG2、7402、SK-Hep-1和正常人肝细胞LO2后形成的克隆集落数的差异;细胞划痕实验检测低氘水对肝癌HepG2、7402、SK-Hep-1和LO2细胞侵袭迁移能力;流式细胞仪检测低氘水对HepG2、7402、SK-Hep-1和LO2细胞周期的变化影响;ATP酶试剂盒测试低氘水对HepG2、SK-Hep-1、7402和LO2细胞的ATP酶表达变化;Western-blot检测低氘水对HepG2、SK-Hep-1、7402和LO2细胞的cylinA、cylinE2、ATP、P21、Phospho-wee1、PCNA等蛋白表达情况。②以HepG2细胞为代表，通过基因芯片分析低氘水对HepG2细胞的miRNAs表达谱;qRT-PCR验证低氘水对HepG2细胞的miRNAs差异表达谱;生物信息学预测靶基因及其功能;划痕实验检测HepG2细胞转染目的miRNAs后细胞侵袭转移能力;RT-PCR检测HepG2细胞转染目的miRNAs inhibit和mimics后的基因表达变化。
　　 结果：⑴低氘水对肝癌细胞和正常肝细胞的增殖和侵袭力影响:随着培养基中氘含量下降，在平板克隆、细胞划痕和MTT实验中，肝癌HepG2、7402、SK-Hep-1细胞集落生成以及细胞游走侵袭能力显著下降(P＜0.05)，但低氘水对人正常肝细胞LO2生长具有促进作用。⑵低氘水能诱导肝癌细胞生长周期阻滞:流式细胞仪检测显示，各肝癌细胞经低氘水处理后细胞G1、G2期静止或略微增加，S期减少(P＜0.05)，而对正常肝细胞生长周期无明显抑制。⑶低氘水抑制肝癌细胞ATP酶活力:ATP酶试剂盒检测结果显示低氘水能显著抑制肝癌细胞Na+K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶和T-ATP酶活力(P＜0.01）。⑷低氘水影响肝癌细胞相关周期蛋白表达:western-blot检测结果显示P21蛋白表达水平显著上调，clylinE2、ATP、cylinA、Phospho-wee1、PCNA等显著下调(P＜0.05或P＜0.01)。⑸低氘水对肝癌细胞miRNAs表达谱差异影响:Affymetrix microRNA芯片比较低氘水(50 ppm)与普通水(150 ppm)处理肝细癌胞HepG2后，miRNAs表达谱差异结果显示差异倍数在两倍以上的miRNA有182个，其中96个高表达，86个低表达;qRT-PCR验证低氘水对肝癌HepG2细胞的miRNAs差异表达谱中的hsa-miR-143、hsa-miR-145-3p、hsa-miR-145-5p的表达，结果显示hsa-mir-143(4.6025±1.214倍),hsa-mir-145-3p(3.8450±2.343倍),hsa-mir-145-5p(3.20750±2.154倍)，(P＜0.05)。⑹hsa-miR-143、hsa-miR-145-3p、hsa-miR-145-5p调控ABCC4和ATP11C基因的表达:生物信息学预测结果显示hsa-miR-143、hsa-miR-145-3p、hsa-miR-145-5p调控的靶基因与肿瘤的增殖、凋亡、转移和多药耐药等相关;miRNAs转染及转染后划痕实验结果显示:ABCC4和ATP11C可能是hsa-miR-143、hsa-miR-145-3p、hsa-miR-145-5p调控的靶基因（P＜0.01）。
　　 结论：①低氘水对人肝癌细胞的增殖及侵袭力具有显著的抑制效应，对正常肝细胞无毒副作用。②低氘水显著影响肝癌相关细胞周期蛋白的表达，通过水通道和ATP酶活性等诱导肝癌细胞G1、G2期的静止和S期阻滞，可能是抑制肝癌细胞增殖和侵袭转移能力的机制之一。③低氘水显著上调hsa-miR-143、hsa-miR-145-3p、hsa-miR-145-5p的表达，负向调控ABCC4和ATP11C的表达(P＜0.01)，并且转染后的划痕实验发现hsa-miR-143、hsa-miR-145-3p、hsa-miR-145-5p的表达上调对肝癌细胞的侵袭能力具有明显抑制作用。因此ABCC4和ATP11C可能是受hsa-miR-143、hsa-miR-145-3p、hsa-miR-145-5p调控的靶基因，也是抑制肝癌细胞增殖和侵袭转移能力的分子机制之一。

目录

声明

摘要

1．前言

1．1 研究背景

1．2 研究目的

1．3 研究内容

第一部分 低氘水对多种人肝癌细胞和正常肝细胞增殖及侵袭力影响

1．实验材料

2．实验方法

3．实验结果

4．讨论

第二部分 低氘水对HepG2增殖抑制的miRNA阵列分析

1．实验材料

2．实验方法

3．实验结果

4．讨论

结论

参考文献

综述 低氘水的抗肿瘤作用研究进展

致谢

附录一：缩写词中英文对照

附录二：在读期间的科研情况