蜡梅小GTP结合蛋白基因CpRAC1的克隆及功能初步验证

摘要

蜡梅[Chimonanthus praecox(L.)Link]为蜡梅科落叶灌木，是我国的传统名花，冬季开花，花香馥郁，是冬季作为切花材料的最佳选择。具有较高的经济价值和观赏价值。目前对蜡梅抗逆性和花发育的分子机制已有所研究，但是对蜡梅生长发育调控机理的研究较为匮乏。
　　Rac/Rop蛋白作为植物小GTP结合蛋白家族的成员之一，在细胞信号传导途径中起着“分子开关”的作用，其通过在GTP激活态和GDP失活态之间的周期性循环与不同的调控因子和下游效应因子相互作用，在植物中执行不同的生物学功能。如与植物的极性生长、抗病抗逆性、激素信号传导、活性氧的产生以及细胞的凋亡等密切相关。
　　在对蜡梅EST序列进行分析的基础上，发现克隆子CH2097对应的EST序列DW0533被注释为小GTP结合蛋白基因，其在蜡梅中的功能还值得探讨。因此，本实验从已构建的蜡梅花cDNA文库中成功分离获得该基因，命名为CpRAC1。并对其结构特征、编码蛋白特征和表达特性进行分析，同时构建植物表达载体通过拟南芥异位表达进行相关研究，以明确其功能。主要试验结果如下:
　　1.CpRAC1基因的结构特征和编码蛋白特征
　　在已构建的蜡梅花cDNA文库EST分析的基础上，通过随机测序的方法分离获得CpRAC1基因的cDNA序列。获得的cDNA序列包含1个597bp的完整开放阅读框(ORF);ProtParam软件在线预测结果表明:蜡梅CpRAC1基因编码198个氨基酸残基，预测分子式为C982H1563N261O283S7;分子量为21.78kD，等电点pI值为9.32;不稳定系数(instability index)为43.19，是一个不稳定的蛋白。
　　利用DNAStar5.0软件进行多重序列比对，CpRAC1蛋白与拟南芥和巴西橡胶树等物种的RAC蛋白同源性高达94％。而且具有GTP/GDP结合区域、Effector（下游效应因子）区域、Rho插入区域、丝氨酸/苏氨酸磷酸化位点、碱性氨基酸区域以及C末端的异戊烯基化位点等保守结构。聚类分析结果表明，CpRAC1基因属于第1类RAC基因，且与拟南芥AtRAC3基因聚为一枝。
　　2.CpRAC1基因的表达特征分析
　　利用实时荧光定量PCR对CpRAC1基因在不同组织、不同开花阶段及不同处理下的表达特性进行分析。结果表明，CpRAC1基因在根、茎、叶、花各组织中均有不同程度的表达，其中在雄蕊中高丰度表达;在不同开花阶段，CpRAC1基因在萌动期和露瓣期几乎不表达，而在初衰期表达量最高，另外该基因在初衰期和衰老期的雄蕊中也有优势表达。H2O2胁迫处理后诱导了CpRAC1基因的表达;外源ABA和赤霉素GA3均使基因的表达受到抑制，推测CpRAC1基因参与H2O2、ABA和赤霉素等信号转导途径。
　　3.CpRAC1基因拟南芥遗传转化研究
　　将构建好的植物表达载体pCAMBIA2301G-CpRAC1转入农杆菌EHA105中，利用花序侵染法转化拟南芥，通过Kan抗性筛选最终获得16个转基因拟南芥T3代株系。根据实时荧光定量PCR结果，选择高表达株系CpRAC1-16、中等表达株系CpRAC1-15和较低表达株系CpRAC1-6进行表型观察和相关处理。
　　转基因拟南芥株系和野生型植株表型观察结果表明:过表达CpRAC1基因延长了植株后期的生长，继而使衰老延迟。另外，转基因拟南芥株系花粉萌发延迟，花粉管明显缩短;茎生叶侧枝数量增多。
　　在外源ABA处理下，转基因拟南芥株系表现出对外源ABA更不敏感;未进行GA3处理时，转基因拟南芥株系的主根长度和侧根数量显著增加，在GA3处理下，野生型植株根系发育几乎达到转基因株系未处理的水平，而转基因对GA3的响应不如野生型植株强烈;过表达CpRAC1基因也明显提高了拟南芥植株叶片的类黄酮和叶绿素含量。说明CpRAC1基因可能通过参与调控ABA、赤霉素、类黄酮等途径，影响了植株的生长发育。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 蜡梅研究进展

1．1．1 形态与分布

1．1．2 种属关系与品种分类

1．1．3 蜡梅的开发和应用

1．1．4 分子生物学在蜡梅研究中的应用

1．2 小GTP结合蛋白概述

1．2．1 GTP结合蛋白

1．2．2 小GTP结合蛋白

1．2．3 小GTP结合蛋白的结构和作用机制

1．2．4 小GTP蛋白的分类和生物学功能

1．3 Rac／Rop蛋白概述

1．3．1 Rac／Rop蛋白的发现

1．3．2 Rac／Rop蛋白的结构特点和分类

1．3．3 Rac／Rop蛋白的作用机理

1．3．4 Rac／Rop蛋白的生物学功能

第二章 引言

2．1 研究背景

2．2 研究目的、内容及意义

2．3 研究技术路线

第三章 蜡梅小GTP结合蛋白基因CpRAC1的克隆和分子特征分析

3．1 实验材料

3．1．1 蜡梅cDNA文库及植物材料

3．1．2 菌株与载体

3．1．3 主要试剂及试剂盒

3．1．4 主要仪器设备

3．1．C5自配的主要试剂

3．2 实验方法

3．2．1 EST序列特征分析及目标克隆子的鉴定

3．2．2 蜡梅CpRAC1基因cDNA序列的获得

3．2．3 蜡梅CpRAC1基因的生物信息学分析

3．3 结果与分析

3．3．1 蜡梅CpRAC1基因cDNA的获得及其序列特征

3．3．2 蜡梅CpRAC1基因编码蛋白的基本特征预测分析

3．3．3 蜡梅CpRAC1基因编码蛋白的同源性分析

3．3．4 蜡梅CpRAC1基因编码蛋白的聚类分析

3．3．5 蜡梅CpRAC1蛋白与拟南芥RAC蛋白的聚类分析与多重序列比对

3．4 讨论

第四章 蜡梅CpRAC1基因的表达特性分析

4．1实验材料

4．2 实验方法

4．2．1 蜡梅不同组织、不同时期及不同胁迫处理材料的采集

4．2．2 总RNA的提取及cDNA第一链的获得

4．2．3 CpRAC1基因表达特性的实时荧光定量分析

4．3 结果与分析

4．3．1 蜡梅总RNA提取

4．3．2 CpRAC1基因的表达特性分析

4．4 讨论

第五章 蜡梅CpRAC1基因表达载体的构建及拟南芥遗传转化研究

5．1 实验材料

5．1．1 植物材料

5．1．2 载体及菌株

5．1．3 试剂盒及主要试剂

5．1．4 自配的主要试剂

5．2 实验方法

5．2．1 蜡梅CpRAC1基因植物超表达载体的构建

5．2．2 杆菌EHA105冻融法感受态的制备

5．2．4 农杆菌转化子的PCR鉴定及反转化大肠杆菌鉴定

5．2．5 花序侵染法转化拟南芥

5．2．6 转基因拟南芥的筛选鉴定

5．2．7 转基因拟南芥的表型观察

5．2．8 转基因拟南芥的花粉离体萌发

5．2．9 转基因拟南芥的激素胁迫处理

5．2．10 类黄酮和叶绿素含量测定

5．3 结果与分析

5．3．1 蜡梅CpRAC1基因植物表达载体的构建

5．3．2 转基因拟南芥的筛选鉴定

5．3．3 转基因拟南芥表型观察

5．3．4 过表达CpRAC1基因影响拟南芥生长发育原因初探

5．4 讨论

5．4．1 蜡梅CpRAC1基因参与拟南芥植株衰老的调控

5．4．2 蜡梅CpRAC1基因影响相关生物学性状

第六章 总结

6．1 主要结果

6．2 下一步计划

参考文献

缩略词表

致谢

在校期间发表文章和参研项目