一个小GTP结合蛋白基因TaRab18及其表达载体和应用

摘要

本发明属于基因工程领域，公开了一个小GTP结合蛋白基因TaRab18及其表达载体和应用。该小GTP结合蛋白基因TaRab18的cDNA序列为SEQ？ID？NO.1及其编码的氨基酸序列为SEQ？IDNO.2。该基因来自普通小麦(Triticum？asetivum？L.)92R137。TaRab18在抗条锈病小麦品种92R137中受条锈菌诱导表达增强，且表达水平远高于在感病小麦品种扬麦158中的表达水平。将该基因插入pBI220获得过量表达载体，并转化感条锈病小麦品种扬麦158，阳性转化植株的T1代抗条锈病鉴定结果表明TaRab18的过量表达可以提高感条锈病小麦品种对条锈病的抗性。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，公开了一个小GTP结合蛋白基因TaRab18及其表达载体和应用。

背景技术

小麦(TriticumaestivumL.)条锈病是由小麦条锈菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)引起的一种危害严重的小麦病害，在世界上60多个国家和地区普遍发生。小麦条锈病主要在小麦叶片上发生，在叶鞘和茎上以及穗部芒上和颖壳也可发生。小麦条锈病具有爆发性强、流行频率高、传播速度快、预防难度大、发生范围广、危害严重等特点。在一般流行年份，小麦条锈病可使小麦减产20％-30％，而大流行年份，其产量损失达到50％-60％，甚至绝收。我国不仅是世界上最大的小麦条锈病流行区，也是一个相对独立的流行区系，并且有自己独特的优势小种。1950、1964、1990、2002、2003和2009年小麦条锈病在我国大范围流行，而在大多数年份局部发病成灾。在过去10年，平均每年约有400万公顷小麦种植地区受到小麦条锈病的影响。

多年来选育和推广小麦抗病品种一直是植病学家和育种工作者致力解决和防治小麦条锈病的主要手段，虽然颇见成效，但由于小麦条锈菌具有高度的遗传变异性，加上小种专化性抗病品种的单一化大面积种植，必然导致新的优势小种在条锈菌种群中产生和发展，最终导致原有品种抗性的丧失。品种抗锈性的屡屡“丧失”，是引起条锈病多次大流行的主要原因，品种抗锈性丧失问题已成为小麦生产上一个世界性难题。因此，加强小麦条锈病抗病新基因的挖掘利用以及抗病遗传基础的理论研究，选育抗条锈病品种，从而有效防治小麦条锈病大面积流行刻不容缓。

小麦品种92R137，含有抗条锈病基因Yr26，自1994年进入国内育种利用以来，Yr26在四川、云南、陕西等条锈病常发区进行了多年种植，对条锈病表现出了稳定的高度抗性，尤其是对小麦条锈菌优势小种条中29、30、32表现高抗-免疫。因此，开展条锈病互作机理研究及重要抗条锈病相关基因的克隆，对于条锈病抗病育种具有重要意义。本发明利用小麦基因芯片技术从转录组水平上了解小麦与条锈菌互作的基因表达特征，从中筛选了一个在92R137中上调表达10倍以上的基因TaRab18，将该基因转入感条锈病小麦品种扬麦158中使基因超量表达，可显著提高小麦的条锈病抗性。本发明提供的TaRab18基因超量表达载体为开展抗条锈病小麦基因工程育种提供基础。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一种小GTP结合蛋白基因TaRab18的表达载体和应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

小GTP结合蛋白基因TaRab18来自普通小麦(TriticumasetivumL.)92R137，其核苷酸序列为SEQIDNO.1。

该小GTP结合蛋白基因的蛋白质为TaRab18，其氨基酸序列为SEQIDNO.2。

含小GTP结合蛋白基因TaRab18的重组表达载体。

所述的重组表达载体优选以pBI220为出发载体，将TaRab18基因插入pBI220的BamH1和KpnI酶切位点间所得。

所述的含小GTP结合蛋白基因TaRab18的表达载体在构建抗条锈病小麦品种中的应用。

有益效果

本发明从小麦中克隆得到了一个小GTP结合蛋白基因TaRab18及其所编码的蛋白质TaRab18，该基因在含有抗条锈病小麦92R137中受条锈菌诱导表达，而在感病小麦扬麦158中不受条锈菌诱导表达。将TaRab18插入超表达载体pBI220，并导入感病小麦品种扬麦158中，可以提高扬麦158对条锈病的抗性。TaRab18用于基因工程育种，将其导入易感条锈病小麦品种中，能够提高小麦的条锈病抗性。

附图说明

图1、Ta.1763.2.S1的RACE及基因组扩增结果

A：5′和3′RACE扩增结果；B：基因全长引物扩增结果。

图2、TaRab18及植物中Rab18/RABC1蛋白保守结构域分析

下划线标出的是TaRab18几个保守亚结构域，G1，G3，G4和G5，为GTP/GDP结合域。

图3、利用Q-PCR分析TaRab18在抗条锈病92R137和感条锈病扬麦158中的表达

横坐标表示条锈菌诱导0、6、12、24、48、72小时的小麦叶片样品。

图4、TaRab18超量表达载体的构建

A：植物表达载体pBI220；B：重组超表达载体pBI220:TaRab18

图5、pBI220:TaRab18部分转基因植株T0代PCR分子鉴定

3-14：转基因植株(4，7，9，10，13为阳性植株，其余为阴性植株)，1：水对照，2：质粒对照，3：扬麦158对照，M：DL2000DNA标准分子量

图6、TaRab18转化扬麦158的T₁代阳性植株的条锈病抗性鉴定

1：抗病对照92R137，2：感病对照扬麦158，3-6：抗性株系

具体实施方式

实施例1受条锈菌诱导表达的具GTP/GDP结合作用的基因TaRab18的克隆

为了克隆Yr26抗病途径中的抗病相关基因，采用基因芯片杂交法筛选抗条锈病小麦92R137与感条锈病小麦扬麦158中的差异表达基因。从中多次筛选获得一上调表达10倍的EST探针Ta.1763.2.S1_at。以此探针序列为基础，通过RACE得到了预期长度的扩增产物(图1A)，拼接后序列长度为1015bp。根据拼接序列设计全长引物P1(CCAGCCATGGACTCTTCTTC，SEQIDNO.3)，P2(AGCTGAAAGCTGCCAAGGTA,SEQIDNO.4)。以抗病小麦92R137cDNA为模板，通过RT-PCR得到预期长度826bp的扩增产物(图1B)，并将其回收、克隆、测序，扩增产物与拼接序列一致。经ORFfinder分析,cDNA序列编码区88～748-bp，长660-bp，序列如SEQIDNO.1所示。编码217个氨基酸，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。经SMART软件(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析，TaRab18编码蛋白序具有4个(GTP/GDP结合所需的结合域(即G1，磷酸结合回环GDSGVG；G3，协调GTP的γ和β磷酸基序DTAGQ；G4，强化鸟嘌呤结合基序GNKVD；G5，帮助鸟嘌呤结合和解离基序ECSAR)、2个分子开关(SwitchⅠ/G2；SwitchⅡ)和1个C端膜定位信号-异戊烯基化基序(CC)(图2)，其中结构域(YRGA)为植物特有。该蛋白序列与短柄草、玉米和拟南芥中的RABC1/Rab18cDNA序列一致性达89％、86％和85％，因此将该基因命名为TaRab18。

实施例2TaRab18基因受条锈菌诱导的表达特征分析

为了研究TaRab18在抗感条锈病材料中的表达模式，利用抗病材料92R137和感病材料扬麦158经条锈菌诱导0、6、12、24、72小时的RNA反转录cDNA为模板，利用P3(CGCAGCCGGACTTCGACTACC，SEQIDNO.5)和P4(CCCAGACGGCGAGCTTGAGC，SEQIDNO.6)为引物进行实时荧光定量PCR(Q-PCR)分析。PCR程序为：PCR反应在实时荧光定量PCR仪(MyIQ，Bio-Rad公司，美国)上扩增并检测荧光。20uLPCR反应体系中含2×SYBRGreenPCRMasterMix10uL，0.5μM引物P3和P4，反转录cDNA模板2uL。扩增参数为：95℃10分钟，然后95℃15秒、60℃30秒，72℃1分钟，共40个循环。反应结束后，进行熔解曲线的测定。检测基因表达水平用MyiQ系统软件进行分析。结果表明，在92R137中，TaRab18受条锈菌诱导上调表达，6小时上调显著，36h后表达水平最高，48和72小时表达已下降；在扬麦158中，TaRab18没有受条锈菌诱导表达的特征，各个时间段的表达量均低于在92R137中的表达量(图3)。

实施例3TaRab18超表达载体构建及其转化普通小麦扬麦158及抗条锈病鉴定

以来自92R137的cDNA为模板，以TaRab18的基因全长序列设计横跨ORF的引物P5(ATCCCGGGTATGGTTGAGTGCACAATGG，SEQIDNO.7)和P6(ATAGGTACCGAGCCTAGATCTTCAGCAGA，SEQIDNO.8)，且P5带有BamH1的酶切位点，P6带有KpnI的酶切位点。使用引物对P5和P6进行PCR扩增，回收扩增片段。用BamH1和KpnI对扩增产物进行双酶切，将酶切产物插入到SmaI和KpnI双酶切后的载体pBI220(JeffersonRA,KavanaghTA,BevanMW.GUSfusions:beta-glucuronidaseasasensitiveandversatilegenefusionmarkerinhigherplants.EMBOJ.1987,6:3901-3907.)中，将TaRab18置于35S启动子后面的多克隆位点处，替换掉载体本身带有的GUS基因。由此将目标基因TaRab18克隆到强启动子35S的下游，获得表达载体pBI220:TaRab18(图4)。

利用基因枪转化方法TaRab18转入感条锈病受体的转化方法如下：1、挑取预培养7天约2000块扬麦158幼胚愈伤组织，在高渗培养基(MS+ABA0.5mg/L+水解酪蛋白500mg/L+2,4-D2mg/L+葡萄糖30g/L+0.4mol/L甘露醇，pH5.8)上预处理4–5小时；2、将携有目的基因TaRab18的过量表达载体pBI220:TaRab18通过基因枪轰击法转化到扬麦158愈伤组织，轰击后在高渗培养基上继续培养16小时。3、将愈伤组织转移至恢复培养基(1/2MS+水解酪蛋白500mg/L+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L，pH5.8)上暗培养2周；4、将愈伤组织转移至含有除草剂的筛选培养基上(1/2MS+ABA0.5mg/L+水解酪蛋白500mg/L+2,4-D1mg/L+蔗糖30g/L+4mg/LBialaphos，pH5.8)筛选培养2周；5、将具有除草剂抗性的愈伤组织转移到分化培养基中(1/2MS+L-谷氨酞胺1mmol/L+水解酪蛋白200mg/L+KT1mg/L+IAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂0.8％，pH5.8)进行分化，待分化芽长至2–4cm时将其转移至生根培养基(1/2MS+KT1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂0.8％，pH5.8)中。6、至再生苗长约8cm、根系较健壮时，即可开管炼苗1–2天，最后洗去根系携带的培养基残渣便可移栽入盆钵。获得再生植株共253棵。

提取所有再生植株基因组DNA，对转化植株利用启动子内部引物P7(AGTTCATTTCATTTGGAGAGAACAC，SEQIDNO.9)和基因内部引物P8(CTGGTTTGTCGAATACAGGT，SEQIDNO.10)进行PCR扩增，以鉴定阳性植株。PCR程序：10-50ng基因组DNA模板，10μM的P5和P6各0.5μl；2.5μl10×buffer；2.5μl2.5mM的dNTP；1.5μl25mM的Mg2+；0.25μl(5U/μl)Taqpolymerase(TaKaRa)，加水至25μl。PCR反应条件为：94℃预变性3分钟；94℃45秒，55℃45秒，72℃2分钟，33个循环；72℃延伸10分钟。PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测。其中64株可以扩增约500bp的目的条带，鉴定为阳性植株。图3所示为部分阳性植株的筛选，从12株转基因植株中鉴定出4株阳性植株。TaRab18转基因T0代阳性植株分单株收货后，将阳性单株的T1代种子种于瓦盆中，每盆20粒种子，并设置92R137和扬麦158对照，种生长箱，待两叶期，接种毒性条锈菌小种条中32，待参照对照扬麦158充分发病后进行病级调查。结果表明：6个株系表现抗病。抗病对照植株92R137对条锈菌表现高抗，叶片上产生过敏性坏死斑，无孢子生长；感病对照植株扬麦158对条锈菌表现高感，无过敏性坏死斑，叶片上布满条锈菌孢子(图4)。以上鉴定结果表明：TaRab18在感病材料中的过量表达可提高感病材料的条锈病抗性，该基因可用于利用基因工程手段培育抗条锈病小麦。