结球甘蓝叶片卷曲关联基因BoLH27和BoSF21的功能研究

摘要

植物叶片的卷曲发育可以改变叶片的平展性，进而影响植物的呼吸作用和光合作用等重要生理过程。对结球甘蓝(Brassica oleracea L.var.CapitataL)而言，叶片的自然卷曲发育是一种非常重要的农艺性状。结球甘蓝是一种世界范围内广泛种植的叶菜类蔬菜，在长期的演化过程中，幼叶、莲座叶和球叶在形态上具有明显的差异。幼叶和莲座叶主要进行平展扩张生长，而球叶向上向内卷曲抱合形成硕大的叶球。目前对植物叶片卷曲发育的研究多见于模式植物拟南芥中，通过自然突变筛选获得多个拟南芥叶片卷曲相关突变体，对其研究发现，bHLH类转录因子、TCP基因和生长素响应因子等对这些突变叶片形态建成和发育均有重要的调控作用。而结球甘蓝具有球叶自然卷曲的典型特性，为研究叶片卷曲提供了理想的材料。然而对甘蓝叶片自然卷曲分子调控机制的研究还未见报道，因此了解甘蓝球叶的自然卷曲发生的遗传规律、揭露这一复杂调控过程中所参与的重要基因，可望为结球甘蓝叶球发育分子机制的研究提供新内容，进而利用分子技术辅助育种对现有品种品质进行遗传改良。
　　为了探索和发掘参与结球甘蓝叶片自然卷曲过程的重要调控基因，并分析其生物学功能，本论文以中熟结球性好甘蓝519为材料，利用转录组技术结合qRT-PCR技术筛选出可能参与叶片卷曲调控的基因BoLH27和BoSF21，克隆并对其序列进行了生物信息学分析，分别构建了两个基因的超量和抑制表达载体，通过农杆菌介导法导入甘蓝，以期探究BoLH27和BoSF21基因在甘蓝叶片卷曲过程中的功能。获得主要研究结果如下:
　　(1)结球甘蓝不同发育时期茎尖与叶片的转录组对比分析与差异表达基因的筛选
　　依据结球甘蓝自然生长状态下叶片形态学上的差异性，我们提取结球甘蓝莲座期和结球期茎尖与叶片总RNA，送百迈克公司（北京）做转录组深度测序分析，用HiSeqTM2000测序完成后，利用Trinity软件对各样品数据分别进行Unigenes组装，共得到54209条Unigenes注释信息。利用IDEG6软件，发现其中莲座期茎尖与叶片间表达存在差异的基因有2923条，结球期茎尖与叶片间表达存在差异的基因有2307条;在莲座期与结球期茎尖间表达存在差异的基因有652条，而在莲座期与结球期的叶片间表达存在差异的基因却有1786条，在上述两时期茎尖和叶片间均差异表达的基因有488条。结合NT、NR、GO、COG、SwissProt、TrEMBL和KEGG等数据库比对分析，通过比较基因log2(结球期叶片RPKM/莲座期叶片RPKM)，依据在结球期叶片间表达差异显著性由高到低的原则结合数据库检索和基因功能注释，从差异基因中发现其中含bHLH类转录因子有15个，生长素响应因子有11个。
　　(2)基于转录组筛选差异基因的qRT-PCR表达分析
　　为了研究转录组所筛选差异基因的表达与甘蓝叶片卷曲表型的关联性，我们用Tips和Actin2基因作为内参，通过荧光定量PCR技术分别对转录组筛选差异基因在不同时期不同类型叶片中的表达水平进行了研究。依据相对表达水平差异显著性，我们从中分别选取了一个差异表达最显著的bHLH转录因子和生长素响应因子，分别命名为BoLH27和BoSF21基因。对BoLH27表达分析发现，在各时期茎尖中的表达差异趋势不明显，而在平展的莲座叶中表达量相对较低，在卷曲程度更明显的球叶中上调表达185.5倍。从莲座期到结球期的生长变化过程中，甘蓝BoLH27在叶片中的表达量在中间期就呈现出显著上调表达;此外，甘蓝BoLH27在不同时期不同类型叶片中的总体表达变化趋势与转录组试验检测其表达差异趋势呈一致性。对BoSF21表达水平分析发现，从莲座期到结球期生长过程中，甘蓝BoSF21在茎尖中的表达水平呈现先降低再升高的趋势;BoSF21在各时期叶片中的表达表现出较大差异，其中在平展的莲座叶中表现出相对较低的表达水平，在卷曲程度更明显的球叶中表达量比莲座叶上调65.33倍。同时，甘蓝BoSF21在不同时期不同类型叶片中的总体表达变化趋势与转录组试验检测其表达差异趋势也完全吻合。由此，说明BoLH27和BoSF21两个基因可能与甘蓝叶片卷曲的调控有关。
　　(3)甘蓝BoLH27和BoSF21基因的克隆与生物信息学分析
　　依据转录组测序所获得的基因序列，结合十字花科和甘蓝基因组数据库，设计特异引物，通过同源克隆获得了BoLH27和BoSF21的cDNA序列，其中BoLH27基因CDS全长为795 bp、编码264个氨基酸;预测理论分子量为30387.05 Da，等电点为4.72;经在线软件对BoLH27编码蛋白进行二级结构分析表明该蛋白主要由27.65％的α-螺旋、12.88％的β-折叠和59.47％的无规则卷曲构成;通过Predictprotein和PROSITE和InterProScan在线预测结果显示:在BoLH27第50～99位氨基酸处具有一个典型bHLH结构域，符合完全保守的13E-16R以及Leu23对应的关键氨基酸位点;分子进化分析表明BoLH27与拟南芥AtbHLH27氨基酸同源相似性最高，达81％，与AtTCP14亲缘关系较远。BoSF21基因CDS全长1035 bp、编码344个氨基酸;预测理论分子量为38082.48 Da，等电点为5.694;经在线软件对BoSF21编码蛋白进行二级结构预测表明该该蛋白主要由34.9％的α-螺旋、12.8％的β-折叠和52.3％的无规则卷曲构成;通过在线软件预测分析显示BoSF21为跨膜蛋白，跨膜区域为115-137氨基酸区段;分子进化分析表明BoSF21与拟南芥BrSF21氨基酸同源相似性最高，达96％，与蓖麻和木棉亲缘关系较远。
　　(4) BoLH27和 BoSF21的转基因功能验证
　　根据BoLH27和BoSF21基因的全长序列，分别设计带有酶切位点的引物，通过与植物表达载体pCAMBIA1300多克隆位点连接，分别构建了含BoLH27的正义表达载体pC35S-35S:senseBoLH27和反义表达载体pC35S-35S:antiBoLH27，以及含BoSF21正义表达载体pC35S-35S:senseBoSF21和反义表达载体pC35S-35S:antiBoSF21。通过农杆菌介导法将上述表达载体分别转化甘蓝下胚轴，经过预培养、侵染、暗培养、愈伤分化、不定芽增殖、生根、炼苗及移栽等过程获得了转基因甘蓝植株。通过提取转基因植株基因组DNA进行PCR鉴定，结果显示均有检测到相应大小的条带，通过对转基因植株中BoLH27和BoSF21定量表达分析也显示，在BoLH27和BoSF21的正反义转基因植株中均有检测到不同水平的超量和抑制表达，初步说明BoLH27和BoSF21均成功整合到基因组DNA上。对转基因甘蓝植株的表型初步观察发现，与野生型植株相比，反义抑制BoLH27的表达对转基因甘蓝叶片卷曲形成叶球的时期有明显提前作用，主要表现在反义抑制BoLH27的转基因植株长势更好，其莲座期叶片表现出球叶的部分性状，主要表型为叶片宽大，基部无叶柄，在叶片基部有丛生叶耳，而正义表达植株和野生型表型差异不显著。而本实验中所获得的BoSF21超量表达和反义抑制转基因植株出苗物候期时间不一致，且与对照的物候期不一致，未能对BoSF21功能进行分析，目前我们已经获得了To代种子，该基因的功能我们课题组将在T1代材料中做进一步后续的分析。

目录

声明

论文说明

摘要

第1章 文献综述

1．1 叶球发育机理

1．1．1 植物器官分化学说

1．1．2 甘蓝的进化过程与叶球发育

1．2 植物叶片卷曲发育分子机制

1．2．1 叶片卷曲相关突变体研究进展

1．2．2 叶片皱缩或波浪卷曲研究进展

1．2．3 叶片极性发育研究现状

1．2．4 bHLH转录因子与植物叶片卷曲

1．2．5 生长素响应因子与植物叶片卷曲

1．3 植物转录组学研究现状

1．3．1 高通量测序技术

1．3．2 基因表达系列分析技术

1．3．3 基因芯片技术

1．4 两种常用基因功能研究策略

1．4．1 目的基因超量表达

1．4．2 反义抑制技术

第2章 引言

2．1 研究的目的与意义

2．2 研究内容

2．3 技术路线

第3章 基于转录组分析和qRT-PCR的甘蓝卷叶关联基因筛选

3．1 实验材料

3．1．1 植物材料

3．1．2 主要生化试剂

3．1．3 主要仪器设备

3．2 方法

3．2．1 用于转录组分析叶片形态学特征的观察与卷曲指数测定

3．2．2 甘蓝组织总RNA的提取

3．2．3 合成cDNA第一链

3．2．4 甘蓝转录组测序试验

3．2．5 甘蓝两类差异基因的表达分析与基因筛选

3．3 结果与分析

3．3．1 甘蓝不同时期叶片差异性分析

3．3．2 甘蓝总RNA质量检测

3．3．3 甘蓝转录组测序数据分析

3．3．4 基于转录组试验筛选的差异基因的qRT-PCR表达分析

3．4 讨论

3．5 小结

第4章 甘蓝BoLH27和BoSF21编码基因的克隆与序列分析

4．1 材料

4．1．1 植物材料

4．1．2 菌株和载体

4．1．3 主要生化试剂

4．1．4 主要溶液及培养基

4．2 方法

4．2．1 引物设计

4．2．2 甘蓝BoLH27和BoSF21的克隆

4．2．3 生物信息学分析

4．3 结果与分析

4．3．1 BoLH27

4．3．2 BoSF21

4．4 讨论

4．5 小结

第5章 植物表达载体构建与甘蓝遗传转化

5．1 材料

5．1．1 植物材料

5．1．2 菌株与质粒

5．1．3 主要生化试剂

5．1．4 激素、抗生素和再生体系培养基

5．2 方法

5．2．1 植物表达载体的构建

5．2．2 甘蓝遗传转化

5．3 结果与分析

5．3．1 含BoLH27和BoSF21的正反义重组质粒的构建

5．3．2 含BoLH27和BoSF21的正反义重组质粒转化农杆菌

5．3．3 转基因甘蓝的获得

5．4 讨论

5．5 小结

第6章 甘蓝转基因植株的分子检测与表型分析

6．1 材料

6．2 方法

6．2．1 植物总DNA提取

6．2．2 转基因植株的PCR检测

6．2．3 转基因植株的荧光定量PCR

6．3 结果与分析

6．3．1 转基因甘蓝gDNA PCR检测

6．3．2 转基因甘蓝的qRT-PCR表达分析

6．3．3 转基因甘蓝表型初步观察

6．4 讨论

6．5 小结

6．6 展望

参考文献

致谢

附录

学期间发表文章、参加项目