牛肝谷氨酸脱氢酶的分离纯化及酶学性质和功能基团研究

摘要

谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase，GDH）是一种广泛存在于生物体的细胞线粒体基质中，连接糖类代谢和氨基酸代谢的关键酶，对细胞内许多代谢过程具有重要的作用，如柠檬酸循环，氮代谢等，主要催化α-酮戊二酸和谷氨酸之间的可逆转化，从而参与谷氨酸的合成与分解；根据GDH在催化反应时所依赖的辅酶类型的不同，可将其分为3类：NAD依赖型（NAD-GDH）、NADP依赖型（NADP-GDH）和NAD(P)依赖型（NAD(P)-GDH）；在生物体内，GDH以四聚体或六聚体的形式存在。
　　GDH在医学药物分析、生物化学分析等领域具有重要的应用价值。迄今为止，已有多种材料来源的GDH得到了深入的研究，但国内还未见有从牛肝中提纯GDH的方法及理化性质研究的相关报道，且所需GDH主要依赖于国外生产。本研究选取来源广、成本低的牛肝脏为实验材料，从中分离纯化出GDH并对其理化性质进行研究，同时利用来源于NCBI上的数据对GDH进行了生物信息学分析，结果如下：
　　1.牛GDH生物信息学分析
　　牛GLUD1的cDNA全长2446 bp，包含13个外显子和12个内含子，ORF全长1686 bp，编码561个氨基酸；氨基酸序列主要含两个保守结构域。ELFV_dehydrog_N结构域和 NAD_bind_1_Glu_DH结构域；与其他几种哺乳动物的GLUD1氨基酸序列全长相似性达93％-99%，与家鸡的相似性为71%，与非洲爪蟾蜍的相似性为85%；在进化关系中，牛与绵羊聚为一支，亲缘关系最接近。
　　2.牛肝GDH的分离纯化
　　新鲜牛肝，经去血后匀浆、Tris-HCL缓冲液抽提、正丁醇脱脂、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析、Superdex-200凝胶过滤层析后获得了电泳纯的牛肝GDH。结果显示GDH的酶活回收率为23.12%，比活力为306.06 U/mg，纯化倍数为93.60倍。
　　3.牛肝GDH的酶学性质研究
　　GDH的全酶分子量约380.20 kD，亚基分子质量约61.7 kD，由此推测该酶由六个相同亚基构成。酶学性质研究结果表明：GDH的最适反应温度为50℃，在20℃~40℃范围内较稳定；最适反应pH值为8.2，在pH5～10范围内较稳定，具有较强的酸碱耐受性；该酶对NADH的Km值为0.696 mmol/L。
　　4.不同金属离子、化合物和有机溶剂对GDH的影响
　　Ba2+、Li+、K+、Mg2+对GDH活性的影响具有两重性，即低浓度激活，较高浓度时抑制，低浓度的Zn2+、Cu2+、Pb2+、Ag+对该酶表现为强烈的抑制作用，Co2+、Ca2+、Cd2+随着浓度的增加抑制作用加强；草酸、尿素、抗坏血酸、SDS对该酶均表现为抑制作用，EDTA对该酶具有一定的激活作用；甲醇、乙醇和异丙醇对该酶具有较强的抑制作用。
　　5.牛肝GDH功能基团的研究
　　通过不同的化学修饰剂对该酶功能基团进行修饰，结果表明：甲硫氨酸的硫醚基，半胱氨酸的巯基以及赖氨酸残基构成牛肝谷氨酸脱氢酶活性中心的必需基团，丝氨酸残基，色氨酸残基，二硫键，精氨酸残基，组氨酸残基及酪氨酸酚羟基与牛肝谷氨酸脱氢酶活性中心的构成没有直接关系，不是该酶活性中心所必需的基团。

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第1章 文献综述

1.1 谷氨酸脱氢酶概述

1.2 谷氨酸脱氢酶的分布

1.3 谷氨酸脱氢酶的分子结构、进化历程及催化机制

1.4 谷氨酸脱氢酶的分离纯化

1.5 谷氨酸脱氢酶的理化性质

1.6 谷氨酸脱氢酶基因工程的研究

1.7 谷氨酸脱氢酶的应用

1.8 系统进化树的构建

第2章 引言

2.1 立题背景与意义

2.2 研究的主要内容

2.3 牛肝GDH分离纯化技术路线

第3章 牛谷氨酸脱氢酶生物信息学分析

3.1 数据来源与方法

3.2 结果分析

第4章 牛肝谷氨酸脱氢酶的分离纯化与酶学性质研究

4.1 材料与试剂

4.2 实验方法

4.3结果与讨论

第5章 牛肝谷氨酸脱氢酶功能基团的研究

5.1 材料与试剂

5.2 实验方法

5.3 结果与讨论

第6章 结论与展望

6.1 主要结论

6.2 展望与建议

参考文献

致谢

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