四种重点黄曲霉毒素与人血清白蛋白的作用及机理研究

摘要

黄曲霉毒素(Aflatoxins,AFs)污染是一个全球的公共问题，在发展中国家尤为严重。其中，黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）是目前已知的最强化学致癌物之一，可通过多种途径污染粮油等农产品、食品和饲料等，直接或间接进入人类食物链。据估计，全球约有50亿人暴露于高水平的AFB1中。
　　人血清白蛋白（Human serum albumin,HSA）是血浆中含量最多的蛋白质，也是人体循环系统中主要的可溶性蛋白组分，能结合、运输许多内源性和外源性化合物，可与外源性物质在特异性部位形成非共价化合物，是研究外源小分子与生物大分子相互作用的模式蛋白，常用于研究生命过程中小分子进入人体血液后的吸收、运输及分布代谢情况。
　　小分子毒素进入人体后，主要通过血液中的血清白蛋白运输到各个器官和组织进行代谢，从而对机体产生毒理作用。目前毒素小分子和人血清白蛋白之间的相互作用，特别是对人体危害较大的真菌毒素分子与血清白蛋白的研究报道很少。根据其他外源药物小分子与人血清白蛋白作用情况推测，HSA与毒素分子的结合作用会直接影响毒素在人体内的自由态浓度。而在机体中，只有自由态的物质才能穿透细胞膜从而对生物产生毒理作用，人体血液中的毒素分子的自由态浓度不仅与血清白蛋白及毒素分子的总浓度有关，也与毒素分子对血清蛋白的亲和力相关。因此，研究黄曲霉毒素分子与HSA的结合作用可以有效的评价毒素的生物效应，更能准确评价其在人体内的毒性。此外研究黄曲霉毒素与HSA的结合作用对于黄曲霉毒素的降毒解毒也起着重要的指导作用。
　　本文在模拟人体血液条件（pH7.4，离子强度0.1），研究了四种黄曲霉毒素（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2）与HSA反应的相互作用，通过荧光淬灭、紫外光谱、同步荧光、三维荧光（Three-dimensional fluorescence,3D荧光）、圆二色谱（Circular Dichroism,CD）以及分子对接等方法，获得了毒素与HSA的结合机理、亲和力常数、结合位点数、结合距离、主要相互作用力、蛋白结构变化及小分子在血清蛋白的结合位点等，从分子层面进行探索，为各种黄曲霉毒素分子在血液中的转运代谢提供理论基础，并分析该结合反应对毒素在体内的毒理效应影响。通过研究和对比存在结构差异的四种黄曲霉毒素分子与HSA相互作用，探索毒素的不同结构或基团对该作用过程的影响。经试验，本文主要结果如下：
　　1.通过研究荧光淬灭光谱发现，四种黄曲霉毒素小分子 B1、B2、G1、G2对HSA均具有较强的荧光淬灭作用。基于Stern-Volmer方程，这四种主要的黄曲霉毒素对HSA的主要淬灭类型为形成基态复合物的静态淬灭。由双对数方程可知，四种黄曲霉毒素与 HSA反应的结合位点数都接近1，说明这四种毒素在与 HSA结合过程中均为1：1结合。在298、303、308、313 K温度条件下，四种黄曲霉毒素与HSA的亲和力常数的数量级都为104，说明黄曲霉毒素与HSA有较强的结合常数，且在同一温度下，四种毒素的淬灭常数与亲和力常数的顺序都为：AFB1>AFG1>AFB2>AFG2，与四种毒素的毒性大小相吻合。
　　2.根据F?rster’s非辐射能量转移理论计算结合过程中四种毒素与HSA中色氨酸的距离，AFB1、AFG1、AFB2、AFG2与HSA的距离分别为3.11nm、3.26nm、3.77nm、3.84nm，表明非辐射能量转移也是毒素小分子淬灭HSA內源荧光原因之一。四种黄曲霉毒素分子与HSA反应后离色氨酸距离大小依次为：AFB1　　3.根据Van’t Hoff方程，四种黄曲霉毒素与HSA反应均为ΔH<0、ΔS>0、ΔG<0的放热反应，且反应能够自发发生，支撑四种黄曲霉毒素与HSA反应的分子间主要作用力是疏水相互作用及氢键。四种黄曲霉毒素分子与HSA结合过程的ΔG大小顺序为：AFB1　　4.通过研究金属离子对不同黄曲霉毒素与HSA反应的影响，结果表明：Zn2+、Cu2+、Mn2+能够降低四种毒素分子与HSA反应的亲和力，在一定条件下，能增加四种黄曲霉毒素分子对人体的急性毒性；而Fe3+则能够增加四个反应的结合常数，有助于毒素分子持久缓释的发挥毒性，增加个体摄入黄曲霉毒素后罹患癌症的风险。
　　5.研究四种黄曲霉毒素与HSA结合后的HSA构象发现：在各种黄曲霉毒素与HSA结合的过程中均会引起HSA的色氨酸残基微环境的疏水性增加，即说明HSA构象的改变引起色氨酸所在的IIA疏水腔周围环境有一定的变化。黄曲霉毒素与HSA的结合也会引起HSA二级结构发生变化，如多肽链的C=O键以及α-螺旋的含量。通过圆二色谱可知，HSAα-螺旋含量为49.27％，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2分别让 HSA的α-螺旋增加到61.07%、54.82%、59.71%、52.81%。四种黄曲霉毒素对HSA二级结构影响顺序为：AFB1>AFG1>AFB2>AFG2。
　　6.分析四种黄曲霉毒素与HSA反应的相关信息参数发现黄曲霉毒素毒性越大，对HSA的淬灭程度越大，亲和力越强，结构破坏程度越大，这为建立基于HSA的黄曲霉毒素毒性的评价标准提供了有用的指导。
　　7.分子对接结果显示，四种主要的黄曲霉素结合在HSA的IB疏水腔中，且与Arg-114、His-146、Tyr-138形成氢键，而配体B1和G1由于双键的存在，能与活性位点残基His-146、Phe-149和Phe-157发生π-π共轭作用，使得两者与HSA的结合更为稳定。B1和G1中五元环上羰基与Arg-114的氢键长度更小，进一步导致B1和G1的结合稳定性大于B2和G2，这与试验研究得到的结合常数大小顺序及反应的吉布斯自由能得到的结果相吻合。

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第1章 文献综述

1.1 粮油产品中霉菌毒素的污染

1.2 黄曲霉毒素性质及其危害

1.3 人血清白蛋白

1.4 毒素分子与人血清白蛋白结合作用研究

1.5 小分子物质与血清蛋白间的相互作用

1.6 小分子与血清蛋白相互作用的研究手段

1.7 研究的意义和内容

第2章 光谱法研究不同黄曲霉毒素与人血清白蛋白的相互作用

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.3 结果与分析

2.4 小结

第3章 不同黄曲霉毒素与HSA结合反应引起的HSA结构变化

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.3 结果与分析

3.4 小结与讨论

第4章 分子对接研究不同黄曲霉毒素与HSA的结合机理

4.1 前言

4.2 使用软件

4.3 方法

4.4 试验结果

4.5 小结与讨论

第5章 结论与展望

5.1 结论

5.2 创新点及展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表论文