藁本内酯恢复ERα阴性乳腺癌细胞对他莫昔芬敏感性及其机制研究

摘要

背景：当归是伞形科植物当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根，具有补血、和血和调经止痛等功效，自古以来多用于妇科方面疾病。挥发油为当归的主要活性成分之一，而藁本内酯（Z-ligusilide，Z-LIG）是其挥发油的主要成分，约占50％以上。雌激素受体α（Estrogen receptor alpha，ERα）阴性表达（ERα-）患者在乳腺癌中约占30%，对传统内分泌治疗药物他莫昔芬（Tamoxifen，TAM）不敏感，临床预后不良，具有较高死亡率。近年发现藁本内酯对结肠癌、前列腺癌、白血病以及脑肿瘤均具有抑制作用。但是关于其主要成分藁本内酯用于 ERα-乳腺癌细胞方面的作用还未有报道。
　　目的：以三种 ERα-乳腺癌细胞为研究对象，探究当归挥发油与藁本内酯是否能够通过恢复ERα-乳腺癌细胞中ERα表达而增敏他莫昔芬的抑制作用，并对藁本内酯如何恢复ERα及与他莫昔芬产生协同抑制作用的机制进行了初步研究，为当归及藁本内酯用于ERα-乳腺癌的临床治疗提供了理论依据。
　　方法：在研究当归挥发油及藁本内酯恢复他莫昔芬对ERα-乳腺癌细胞的抑制作用方面：首先，采用黄酰罗丹明B（SRB）法，以当归挥发油或藁本内酯与他莫昔芬单独或合用处理三种 ERα-乳腺癌细胞（MDA-MB-231、HS578t和 MDA-MB-453）72h。同时，用苔盼蓝拒染法和克隆形成实验考察了藁本内酯与他莫昔芬对此三种细胞的增殖及克隆形成能力的影响。在进一步的机制研究中，我们用流式细胞仪、Hochest33342染色和Western blotting实验分别对凋亡和周期进行了探究。在探究藁本内酯对ERα表达的影响及ERα在藁本内酯与他莫昔芬协同抑制活性中的作用方面：以当归挥发油与藁本内酯分别处理此三种ERα-乳腺癌细胞，用Western blotting对ERα蛋白表达情况进行了检测。此外，为检恢复的ERα对雌激素应答活性元件（ERE）活性的影响，我们采用荧光素酶报告基因检测系统进行了检测。最后用ERα蛋白拮抗剂-氟维斯群（ICI182780）及si-ERα方法，通过SRB、克隆形成等实验评估了所恢复的ERα在藁本内酯与他莫昔芬协同作用中的地位。在藁本内酯恢复 ERα表达的机制方面：结合研究报道，我们从组蛋白 H3（lys9/14）的去乙酰化角度进行了相关实验。首先，我们用Western blotting检测了藁本内酯不同剂量和时间点对MDA-MB-231细胞中Ace-H3（lys9/14）的表达影响。然后，用染色质免疫沉淀（ChIP）法观察藁本内酯对细胞ERα启动子上Ace-H3（lys9/14）结合水平有无影响。其次，我们用Western blotting考察了能够抑制ERα转录活性相关因子MTA1、IFI16与HDACs（HDAC1、HDAC2与HDAC4/5/7）的表达情况，用ChIP法检测了这些因子在ERα启动子上的结合情况。并给药藁本内酯检测对它们在细胞内表达和在ERα启动子上结合的影响。同时，我们用基因过表达的方法，将MTA1、IFI16、HDAC1和HDAC7分别过表达后，考察它们对藁本内酯上调ERα的能力和藁本内酯与他莫昔芬协同抑制作用所产生的影响。最后，我们通过免疫沉淀（IP）实验检测了藁本内酯对以 MTA1为主体招募 IFI16与HDACs（HDAC1、HDAC2与HDAC4/5/7）因子所形成复合物稳定性的影响。
　　结果：当归挥发油与他莫昔芬处理三种ERα-乳腺癌细胞（MDA-MB-231、HS578t和MDA-MB-453细胞）72h后，结果显示二者单独对此三种细胞的存活率均无明显抑制作用，但当合用时，却对此三种细胞均产生显著抑制作用，其中MDA-MB-231最为敏感。随后，考察藁本内酯与他莫昔芬的作用，发现二者合用对此三种细胞的存活率亦显示出类似的协同抑制作用，且同样观察到MDA-MB-231较另外两种细胞更敏感。进一步的苔盼蓝拒染法和克隆形成实验显示藁本内酯与他莫昔芬合用可显著抑制此三种细胞的增殖与克隆形成能力。在随后的凋亡和周期机制探究中，流式细胞仪和Hochest33342染色得出藁本内酯与他莫昔芬可以诱导细胞发生近2倍凋亡率，且细胞核明显变亮和皱缩破碎。同时细胞的S和G2/M期发生明显阻滞。而进一步的Western blotting检测发现，二者合用可以通过诱导凋亡标志性蛋白 p53上升，进一步促进了 pro-PARP、pro-caspase3、cleaved-PARP和cleaved-caspase3转换表达而促进细胞凋亡。此外，还能够通过上调Acetyl-p53与BRCA1表达，进一步使p21上调，同时促进周期阻滞蛋白p27而使与S和G2/M期有关的CDK1、CDK2、Cyclin A与 Cyclin E蛋白含量下降而阻滞周期。用Western Blotting实验发现当归挥发油（10、20与40μg/mL）与藁本内酯（10、25与50μM）均能恢复三种ERα-乳腺癌细胞中ERα的表达。且藁本内酯上调ERα后能进一步激活下游启动子ERE的活性，而单独的他莫昔芬对其无作用，但他莫昔芬能阻断藁本内酯对ERE的激活。用氟维斯群（ICI182780）或si-ERα处理后，由于降低了藁本内酯对ERα的恢复，造成藁本内酯与他莫昔芬的协同抑制作用被逆转。在ERα恢复机制研究中，Western Blotting显示随着藁本内酯（10、25与50μM）剂量及时间点（0、24、48与72h）增加，Ace-H3（lys9/14）蛋白含量逐渐增加。而参与组蛋白修饰的MTA1、IFI16与HDACs（HDAC1、HDAC2与HDAC4/5/7）蛋白均被下调。通过ChIP实验，我们发现藁本内酯（50μM）可以通过降低MTA1、IFI16与HDACs（HDAC1、HDAC2与HDAC4/5/7）在ERα启动子上的富集，而增加Ace-H3（lys9/14）在ERα启动子的结合水平。进一步过度表达MTA1、HDAC1、HDAC7与IFI16，我们发现藁本内酯上调ERα的能力被减弱，同时，藁本内酯与他莫昔芬的协同抑制作用也被反转。最后，IP实验显示， MTA1与其它因子均有相互结合。但藁本内酯（50μM）给药后，可能由于藁本内酯降低了它们各自的表达而使得MTA1与其它因子结合程度均明显降低，从而影响了MTA1/IFI16/HDACs所形成的NuRD复合物稳定性。
　　结论：藁本内酯能够通过降低MTA1、IFI16和 HDACs（ HDAC1、HDAC2与HDAC4/5/7）表达及在ERα启动子上的结合，而影响MTA1/IFI16/HDACs所形成的NuRD复合物稳定性，使得ERα启动子上组蛋白H3（lys9/14）乙酰化水平增加，最终使ERα恢复表达，从而使他莫昔芬对ERα-乳腺癌细胞产生抑制作用，且此协同抑制作用与诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞相关。

目录

声明

前言

第一章 当归挥发油与藁本内酯恢复他莫昔芬对ERα-乳腺癌细胞抑制作用初步研究

1仪器与材料

2实验方法

3实验结果

4 实验讨论

5 实验结论

第二章 藁本内酯与他莫昔芬对MDA-MB-231细胞凋亡与周期作用的影响

1 仪器与材料

2 实验方法

3 实验结果

4 实验讨论

5 实验结论

第三章 ERα在藁本内酯与他莫昔芬协同效应中的作用研究

第1节 藁本内酯恢复ERα-乳腺癌细胞中ERα表达

第2节 ICI182780与si-ERα逆转藁本内酯与他莫昔芬的协同抑制作用

第四章 藁本内酯恢复ERα表达的机制研究

第1节 藁本内酯提高组蛋白H3乙酰化水平及在ERα启动子上的结合

第2节 藁本内酯降低MTA1、IFI16和HDACs表达及其在ERα启动子上的结合水平

全文总结

创新点及意义

思考与展望

参考文献

综述：雌激素受体α的表观遗传机制及天然化合物对乳腺癌的化学预防

致谢

硕士学位期间科研工作汇报

附：中英文缩略名词对照表