重组人白细胞介素-7及其剪接变异体蛋白的表达、复性和纯化

摘要

白细胞介素-7（interleukin-7，IL-7）是一种多潜能的细胞因子，能促进B和T淋巴细胞生存、分化和增殖，在T细胞稳态调节中起关键作用，且能诱导CTL和巨噬细胞的细胞毒活性，因此，IL-7对T细胞耗竭的病人（如癌症、骨髓移植及AIDS）有非常好的治疗潜能。近年来人们在不同的肿瘤组织中发现了分子大小不同的IL-7剪接变异体（如IL-7-δ4、IL-7-δ4/5、IL-7-δ3/4等），推测其可能参与调节IL-7的生物活性。因此，本课题利用原核表达系统表达、复性和纯化重组人IL-7（recombinant human IL-7，rhIL-7）及其剪接变异体蛋白（rhIL-7-δ4、rhIL-7-δ4/5、rhIL-7-δ3/4），并利用免疫印迹技术对其进行鉴定，为其生物活性研究打下基础。
　　目的：本课题在已经成功构建IL-7及其剪接变异体的原核表达载体pET21b-IL-7、pET21b-IL-7-δ4、pET21b-IL-7-δ4/5和pET21b-IL-7-δ3/4的基础上，表达、复性和纯化rhIL-7、rhIL-7-δ4、rhIL-7-δ4/5和rhIL-7-δ3/4蛋白，为其生物活性研究打下基础。
　　方法：⒈rhIL-7及其剪接变异体蛋白的表达：对各保种菌重新进行PCR鉴定和测序鉴定后，测定生长曲线，以确定最佳IPTG诱导时机，并对各重组蛋白进行诱导表达和可溶性分析，优化IPTG诱导浓度和诱导时间，以确定最佳表达参数，SDS-PAGE分析表达产物。
　　⒉rhIL-7及其剪接变异体蛋白的复性：各重组蛋白以包涵体形式表达后，通过梯度透析的方法复性，复性液A、B、C、D、E中分别含4、3、2、1、0 M盐酸胍（Gu-HCl），并在复性关键步骤中加入L-精氨酸（L-Arg）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）和还原型谷胱甘肽（GSH）等复性辅助试剂以提高复性效率，采用BCA法测定蛋白液复性前后的浓度以计算各蛋白的复性效率。
　　⒊rhIL-7及其剪接变异体蛋白的纯化和Western Blot鉴定：采用Ni2+亲和层析色谱法纯化各重组蛋白，上样后经Binding Buffer（30 mM咪唑）洗脱非特异性结合的杂蛋白，再分别用Elution Buffer A（60 mM咪唑）、B（100 mM咪唑）、C（300 mM咪唑）进行梯度洗脱，分阶段收集洗脱液，SDS-PAGE、BandScan软件分析各蛋白纯度，BCA法测定纯化后的各蛋白浓度。分别以6×His小鼠单克隆抗体和鼠抗人IL-7抗体为一抗，辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠IgG为二抗对纯化后的各重组蛋白进行Western Blot鉴定。
　　结果：⒈rhIL-7及其剪接变异体蛋白的表达：PCR扩增出的片段大小与预期的IL-7（531bp）、IL-7-δ4（399bp）、IL-7-δ4/5（345bp）、IL-7-δ3/4（318bp）一致，且测序结果与已报道的序列一致。rhIL-7、rhIL-7-δ4、rhIL-7-δ4/5、rhIL-7-δ3/4蛋白均能在大肠杆菌BL21(DE3)中获得良好表达，分别在17.4 kDa、12.4 kDa、10.3kDa、9.3kDa附近有一明显的条带，且均为包涵体形式表达。生长曲线分析和表达条件优化结果显示，rhIL-7、rhIL-7-δ4、rhIL-7-δ4/5、rhIL-7-δ3/4蛋白最佳诱导时机分别为：37℃、180 rpm培养1.5 h、2h、2.3h、1.8h；其最佳表达条件分别为（37℃、180rpm条件下培养）：1.0mM IPTG诱导2h、0.4mM IPTG诱导2 h、0.6mM IPTG诱导3 h、0.8mM IPTG诱导2 h。
　　⒉rhIL-7及其剪接变异体蛋白的复性：rhIL-7、rhIL-7-δ4、rhIL-7-δ4/5、rhIL-7-δ3/4蛋白的复性效率均较好，分别约为50％、48%、45%、65%，且该复性方法重复性良好，可用于各重组蛋白的大量制备。
　　⒊rhIL-7及其剪接变异体蛋白的纯化和 Western Blot鉴定：SDS-PAGE、BandScan软件分析显示，各重组蛋白的纯化效果较好，其纯度均达到了95%以上，BCA法测定其纯化后的浓度均约为0.1 mg/mL。以6×His小鼠单克隆抗体为一抗的Western Blot鉴定结果显示，rhIL-7、rhIL-7-δ4、rhIL-7-δ4/5、rhIL-7-δ3/4分别在17.4kDa、12.4kDa、10.3kDa、9.3 kDa附近出现条带；以鼠抗人IL-7抗体为一抗的Western Blot鉴定结果显示，rhIL-7、rhIL-7-δ4分别在17.4 kDa、12.4 kDa附近出现条带，而rhIL-7-δ4/5、rhIL-7-δ3/4分别在10.3 kDa、9.3 kDa处没有条带；Western Blot鉴定结果与预期结果相符，表明各重组蛋白均获得有效表达。
　　结论：本研究采用原核表达系统表达rhIL-7、rhIL-7-δ4、rhIL-7-δ4/5、rhIL-7-δ3/4蛋白，确定了最佳表达参数；经SDS-PAGE分析显示，各重组蛋白均为包涵体形式表达，经梯度透析法复性后，各重组蛋白的复性效率均较好，分别约为50%、48%、45%、65%；采用Ni2+亲和层析色谱法纯化后，各重组蛋白的纯化效果较好，其纯度均达到了95%以上，BCA法测定其纯化后的浓度均约为0.1 mg/mL；经Western Blot鉴定结果显示，各重组蛋白均获得有效表达。因此，成功获得了高纯度的rhIL-7、rhIL-7-δ4、rhIL-7-δ4/5、rhIL-7-δ3/4复性蛋白，且该技术方法稳定性较好，有利于各重组蛋白的大量制备，为其生物活性研究打下了物质基础。

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中文摘要

英文摘要

第一章 序 言

1.1 研究背景

1.2 研究路线

第二章 rhIL-7及其剪接变异体蛋白的表达

2.1 前言

2.2 实验材料

2.3 实验方法

2.4 实验结果

2.5 讨论

第三章 rhIL-7及其剪接变异体蛋白的复性

3.1 前言

3.2 实验材料

3.3 实验方法

3.4 实验结果

3.5 讨论

第四章 rhIL-7及其剪接变异体蛋白的纯化和Western Blot鉴定

4.1 前言

4.2 实验材料

4.3 实验方法

4.4 实验结果

4.5 讨论

全文总结

研究展望

参考文献

攻读学位期间发表的论文

附录1 英文缩写语中文对照

致谢