年龄对人骨髓间充质干细胞生长特性及成骨潜能的影响

摘要

目的:组织工程为创伤、肿瘤、严重感染等造成的大段骨缺损的修复提供了新的治疗方法.随着临床上组织工程应用的推广,种子细胞的来源成为人们重点研究的问题.hMSCs是目前较为理想的组织工程种子细胞来源,但不同年龄的hMSCs体外增殖、分化特点有很大差异.不同年龄供体的hMSCs生长特性是否存在差异以及高龄供体hMSCs是否能满足修复自身骨缺损的需要尚缺少系统的研究,该实验通过对人不同年龄段样本的研究,观测了各年龄段样本的种子细胞体外增殖、成骨分化以及裸鼠皮下成骨能力,为下一步组织工程骨修复骨缺损的临床应用提供参考.方法:1、年龄分组:样本来自39例7~79岁健康志愿者骨髓,按人骨骼发育和激素分泌水平分为<20(9例),20~39(10例),40~60(11例),>60(9例)四组.2、获取健康志愿者骨髓,分离hMSCs进行原代、传代和诱导培养,记录单个核细胞获取数、传代时间、细胞收获数、倒置显微镜观察细胞生长情况.3、取样进行细胞透射电镜观察.4、取第2代细胞用流式细胞仪分析细胞周期.5、取第2代细胞5×10<'3>/孔密度接种于96孔培养板,于第1~8天每天用MTT法分析骨髓基质细胞的存活和增殖能力.6、取第2代hMSCs以1×<'5>/ml接种于6孔培养板,加入成骨诱导培养基,分别于2、4、6、8、10、12、14天消化细胞,进行ALP活性检测.7、取第2代细胞爬片,进行ALP、I型胶原和骨钙素免疫组化及钙染色.8、取第2代5×10<'4>/ml hMSCs 2ml以接种于6孔培养板, 于第4天和第8天换液前取培养基1ml,用放免法定量检测骨钙素含量.9、每个年龄组随机抽取2个样本,取第2代hMSCs用成骨诱导培养基培养,将诱导后的细胞复合人脱钙骨(DBM)种入裸鼠皮下.分别于第4、8、12星期进行X摄片、HE及免疫组化染色并进行图像分析.结果 1.低龄组(<20)样本细胞较高龄组(>60)形态好、传代时间短、增殖能力强,但各年龄组细胞数量均能满足组织工程骨构建的需要.2.低龄组与高龄组样本的原代细胞、诱导后细胞在电镜下无明显区别.3.细胞周期分析显示,低龄组样本较高龄组样本增殖期细胞比例高、静止期细胞比例低、凋亡率较低,低龄组与高龄组存在非常显著性差异(P<0.01).4.MTT法结果显示低龄组样本增殖能力和活性较高龄组高,低龄组与高龄组存在非常显著性差异(P<0.01).5.诱导后各年龄组细胞ALP、I型胶原和骨钙素免疫组化及钙染色呈阳性反应,未诱导细胞染色呈阴性反应.6.低龄组样本诱导细胞ALP活性较高龄组高,低龄组与高龄组存在非常显著性差异(P<0.01).7.第4天和第8天成骨诱导上清液骨钙素浓度随着年龄的增长而呈下降趋势,低龄组明显高于高龄组,低龄组与高龄组存在非常显著性差异(P<0.01).8.植入裸鼠皮下的组织块在X片中的显影密度随时间的增加而增高,低龄组样本呈高密度显影. 12周时组织切片HE染色显示低龄组皮下组织块有骨组织形成,60岁以上组样本组织块内有大量成骨细胞,有少量组织矿化.9. 免疫组化染色图像分析结果显示低龄组与高龄组皮下组织块I型胶原和骨钙素表达存在非常显著性差异(P<0.01).结论 1.取得了各年龄组hMSCs培养的时间、密度参数.2.不同年龄组之间增殖、成骨分化的差异具有显著性意义,随着年龄的增长其增殖、成骨分化能力也相应降低.3.hMSCs成骨诱导后具有成骨细胞活性表达.4.低龄组样本在裸鼠皮下能成骨,其成骨能力大于高龄样本,60岁以上组样本成骨能力低下,所需时间长,不能很好达到临床修复骨缺损的要求.

目录

文摘

英文文摘

英文缩写词表

前言

第一部分不同年龄人骨髓间充质干细胞体外增殖及成骨分化的研究

第二部分不同年龄人骨髓间充质干细胞裸鼠皮下成骨能力的研究

全文结论

致谢

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参考文献

文献综述不同年龄供体间充质干细胞在骨组织工程中的应用

研究生期间撰写、发表的文章