人骨髓间充质干细胞生长特性及碱性成纤维细胞生长因子对其增殖的影响

摘要

目的:观察人骨髓间充质干细胞的生长特性及表面标记,探讨碱性成纤维细胞生长因子对其增殖的影响。方法:实验于2003-02/2005-10在大连医科大学附属第一医院中心实验室、苏州大学附属儿童医院骨科实验室完成。①骨髓组织均取自单纯性骨囊肿行自体骨髓注射治疗的患者,年龄10～16岁,全部在患者家属的同意下,于后方髂嵴骨髓穿刺,一次性采集骨髓20mL。Percoll梯度离心,附壁筛选人骨髓间充质干细胞进行原代培养。②原代接种后48h换液,待贴壁细胞即将铺满瓶底时用胰酶消化分离,按3×103/cm2密度接种于6孔培养板,记为P1;传代培养过程中贴壁细胞彼此融合,铺满整个培养板的底面时,再重复以上操作,记为P2,以此类推,传代培养直至细胞出现衰老征相。③取第2代间充质干细胞,消化后计数2×105细胞与抗CD34,CD44抗体室温反应30min,流式细胞仪分析细胞表型。④将生长良好的第2代人骨髓间充质干细胞以500个/孔种植在96孔培养板中,加入完全培养液的同时,再加入碱性成纤维细胞生长因子,使其成为浓度分别为0,1,5,10,25,50,100μg/L的条件培养基,每个浓度重复5孔。培养2d后,于各小孔内加入5g/L噻唑蓝20μL,继续培养4h后每孔加入二甲基亚砜200μL,用酶标仪在492nm波长下检测人骨髓间充质干细胞增殖情况。⑤实验分组同上,各培养孔加入TritonX-100100μL,4℃过夜,每孔加入碱性磷酸酶底物液150μL,酶联免疫监测仪测定410nm波长下人骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶的活性。结果:①人骨髓间充质干细胞原代和传代培养的生长曲线分析:原代接种后5～9d为细胞生长潜伏期,11～16d为对数增殖期,18～20d为生长平台期。传代培养细胞生长潜伏期为12～24h,对数增殖期为7～10d,11～13d进入细胞生长平台期。②人骨髓间充质干细胞的表型:人骨髓间充质干细胞均一表达CD44,不表达CD45。③碱性成纤维细胞生长因子对人骨髓间充质干细胞增殖及碱性磷酸酶活性的影响:与空白对照比较,较低浓度的10μg/L碱性成纤维细胞生长因子即可显著促进人骨髓间充质干细胞增殖(t=2.852,P<0.05),且与其浓度成正性量效关系。25～100μg/L碱性成纤维细胞生长因子对人骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶的活性均可产生显著抑制作用(t=3.248,P均<0.05)。结论:人骨髓间充质干细胞可在体外迅速扩增,碱性成纤维细胞生长因子对其增殖作用与浓度成正性剂量-效应关系。