大鼠星形胶质细胞在突触形成与传递中的作用及其可能机制的探讨

摘要

在中枢神经系统中，突触周围一般都有星形胶质细胞的突起包绕，因此星形胶质细胞被看成是继突触前、后成份之后构成突触的第三成份。这些包绕突触的胶质细胞对突触到底如何起作用至今知之甚少。近十几年的研究表明，胶质细胞除起支持、分隔和营养作用外，还有调节神经元间的信号传递、神经分泌等作用，但对突触形成及突触可塑性作用的报告不多。胶质细胞能直接影响突触形成的证据主要源于Pfrieger和Barres等的工作，他们发现星形胶质细胞培养液能显著增加大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)形成突触的数量。迄今为止，在培养的海马、下丘脑、脊髓及干细胞来源的神经元上也得到同样的结果，而且发现外周神经系统施万细胞也参与神经肌肉连接处突触的形成和维持。但星形胶质细胞是通过何种机制影响突触形成和可塑性的至今尚不清楚。 以往的研究已显示，脑内固醇类物质如雌激素参与了神经系统的发育、性分化、生理和病理等，同时也被证明参与了部分突触功能的调节，故被称为“神经活性固醇(neuroactivesteroids)”。本室曾研究证明胶质细胞瘤和神经干细胞中有高活性的芳香化酶表达，芳香化酶是神经类固醇物质代谢过程中关键的酶，能催化雄激素转化为雌激素，这提示星形胶质细胞可能合成雌激素。另外我们发现神经元中有丰富的ER-alpha和ER-beta两种雌激素受体(ER)表达。因此推测胶质细胞合成并分泌的雌激素可能通过雌激素受体作用于神经元，激活下游信号，参与了突触的形成与信息传递的调节过程。为验证我们的假设，本实验以纯培养新生大鼠皮层神经元为模型，用细胞培养、ELISA、免疫荧光技术、突触记数、膜片钳技术和FM4-64活体染色标记的突触囊泡释放实验等方法探讨星形胶质细胞(AST)是否参与突触的形成和信息传递，及其可能的作用分子。我们实验获得的主要结果汇报如下： 1.纯培养的星形胶质细胞能合成并分泌雌激素，而纯培养神经元的上清液中则检测不到雌激素 在第一部分的实验中，我们首先对文献报道的原代皮层胶质细胞和神经元纯化和培养方案进行了优化，进行了新生大鼠皮层星形胶质细胞(astrocytes，AST)和神经元的纯培养，同时用免疫细胞化学法对培养的AST和神经元进行了胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)和神经元微管相关蛋白(microtubule-associatedprotein2，MAP2)及神经丝蛋白200(neurofilament200，NF200)的免疫组化染色，并行细胞计数，结果显示培养纯化后的AST和神经元的纯度均可达99％以上。通过ELISA方法检测星形胶质细胞传代培养至第2h、7d、14d和21d时的星型胶质细胞条件培养液(astrocyte-conditionedmedium，ACM)中雌激素E2的浓度，分别为(ng/L)：0、117±21、266±22、252±27。对照组各时相点均未检出E2。雌激素浓度在培养初期随着时间的延长而增加，第14d时达到高峰，此后分泌能力有所降低，21d时仍保持较高的浓度。而纯培养的大脑皮层神经元在2d，4d，8d和13d时的培养上清中则未测得E2的存在。上述结果表明，后续实验中当ACM加入纯培养的神经元时，内源性的E2主要来源于AST，而非神经元自身产生。 2.外源性雌激素能够基本模拟ACM(或AST)促突触形成和增强突触传递的作用在这部分实验中，我们以纯培养之神经元(GroupP)、与AST混合培养的神经元(GroupM)、加有ACM纯培养的神经元(GroupA)及加有外源性E2的纯培养神经元(GroupE)为研究对象(即实验分4组)，应用突触计数和膜片钳技术观察了各组突触形成的数量和微小突触后电流(minipostsynapticcurrents，mPSCs)的幅度及频率。其中GroupP，A，M和E的突触数量(个/细胞)分别为：14±3，79±9，83±11，80±9；各组mPSCs的幅度与频率依次为20.5±2pA，13±4/min；29.1±3pA，73±16/min；31.3±3pA，78±20/min；30.2±3pA，76±18/min。上述结果显示加有ACM纯培养的神经元与AST混合培养的神经元具有同样的促突触形成和增强mPSCs的幅度及频率的作用，两者明显高于纯培养神经元形成的突触数量和mPSCs的幅度及频率，这表明AST促进突触形成和传递的作用主要是通过旁分泌而不是直接接触起作用的，分泌的因子溶解在ACM中通过扩散作用到达神经元引起效应。当外源性E2加入纯培养的神经元中时，发现也具有促进突触形成和传递的作用，且基本能够模拟ACM和AST的效应。结合第一部分的实验结果，我们可以这样推理：AST促突触形成和增强mPSCs的作用主要通过分泌至ACM中的因子介导，而这个可溶性因子很有可能是AST自身分泌的雌激素E2。为进一步验证这一假设，同时也为探讨胶质源性的E2促突触发生及传递作用的可能机制，我们进行了下面的实验。 3.胶质源性的雌激素可能通过雌激素受体(estrogenreceptor，ER)介导其促突触形成及增强突触传递的作用 实验中我们发现纯培养的神经元中能够表达ER，且免疫荧光显示主要存在细胞核中。众所周知，雌激素引起生物学效应的主要信号通路是通过其受体ER转导的基因机制生效(但现在也发现部分雌激素的生物学效应还通过非基因机制起作用)，如果胶质源性的E2确实是ACM促突触发生及传递作用的主要分子，则应用ER阻断剂则可以阻断ACM的作用。因此我们在ACM加入纯培养神经元的同时加入ER阻断剂Tamoxifen(GroupA+T)，同时设立对照组即只加有Tamoxifen的纯培养神经元(GroupT)和纯培养神经元(GroupP)，结果发现Tamoxifen加入后，加有ACM的纯神经元中突触形成的数量由79±9个显著下降为32±3个；mPSCs的幅度与频率均下降，分别为24.5±2pA，35±10/min。对照组GroupT的相应数据为29±3个；22.13±2pA，37±10/min，但均大于纯培养神经元(GroupP)的相应参数。可以看出胶质源性的E2基本是ACM促突触发生及传递作用的主要分子，并且主要通过ER起作用，但有趣的是Tamoxifen并不能完全阻断ACM的作用。最后，为进一步弄清胶质源性的E2是否通过突触前机制调节突触的传递功能，我们进行了FM4-64活体标记的囊泡释放实验，结果表明GroupA，M和E三组囊泡释放动力学特点基本相似，释放的速度和彻底度明显强于GroupP，同样Tamoxifen能明显抑制ACM的促囊泡释放作用。 综上所述，本研究发现AST在中枢神经系统中除具有传统的作用外，还具有促进突触形成和传递的作用，这一作用主要通过AST自身合成并分泌到ACM中的E2实现，并通过ER引起下游信号的激活，导致突触形成增加，突触前囊泡释放增强，从而引起突触信号传递效率的正性变化。

目录

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摘要

引言

总材料与方法

第一部分体外纯培养星形胶质细胞和神经元雌激素分泌的实验研究

材料及方法

实验结果

结论

第二部分星形胶质细胞条件培养液(ACM)及外源性雌激素影响突触形成与突触传递功能的实验研究

材料及方法

实验结果

结论

第三部分星形胶质细胞或ACM促进突触形成与功能的可能机制的探讨

材料及方法

实验结果

结论

全文讨论

全文总结

致谢

参考文献

文献综述类固醇和脑功能的研究进展

学习期间发表和交流的文章