远志皂苷对大鼠海马神经元突触传递的作用的试验方法

摘要

本发明公开了一种远志皂苷对大鼠海马神经元突触传递的作用的试验方法，该方法采用微操控制仪、显微镜和记录电极等设备，对神经细胞对于远志皂苷在不同药物下自发电流状态进行监测，并将监测电流数据进行分析，最终得出远志皂苷对大鼠海马神经元细胞的影响机理和作用。该方法采用全细胞膜片钳技术研究远志皂苷对大鼠脑部海马CA1区自发突触后电流的影响，以揭示远志皂苷对神经细胞突触传递调控作用和机理，从而满足科研和药物开发的试验需求，同时也能够为神经细胞的信号传递机理作出进一步的研究。在神经细胞的各种药物原理研究中能够广泛使用，并且试验方法和设备设计科学合理，能够满足科研的要求。

说明书

 

技术领域

本发明涉及一种药物对神经元作用的试验方法，具体涉及一种远志皂苷对大鼠海马神经元突触传递的作用的试验方法。

背景技术

远志(Radices polygalae)系远志科远志属植物远志Polygala tenuifoliaWilld.的干燥根，在中国的传统医学中，一直被视为具有安神益智的功效，因此在脑功能方面的研究得到了广泛关注，远志皂苷 (tenuigenin，TEN) 是从远志分离出来的一类主要的活性成份，在抗衰老、益智、抗氧化、等方面具有广泛的生物活性，TEN能在神经元保护及认知功能的改善等方面具有促进作用。TEN能通过抑制Aβ蛋白的分泌而起到保护神经元的作用，我们在前期工作中也发现TEN能明显改善动物的学习记忆能力，能保护培养神经元抵抗H₂O₂的损伤；大脑的海马结构是脑中枢内与学习、记忆等神经功能密切相关的一个重要脑区，因此海马内神经元突触传递的变化对学习记忆等神经功能具有重要的影响，然而，迄今为止，仍没有直接证据表明TEN对神经元突触传递具有调控作用。

现有的药物试验方式，对于神经性药物对神经细胞作用原理的试验不能够达到理想的效果。对于特定神经性药物的药理作用机理的研究不能够完全的探究清楚。因此，不能够满足神经性药物的药理研究。

因此本发明实验方法采用全细胞膜片钳技术研究TEN对大鼠海马CA1区自发突触后电流的影响，以揭示TEN对神经细胞突触传递调控作用和机理，从而满足科研和药物开发的试验需求。

发明内容

本发明需要解决的技术问题就在于克服现有技术的缺陷，提供一种远志皂苷对大鼠海马神经元突触传递的作用的试验方法。该方法采用全细胞膜片钳技术研究远志皂苷对大鼠脑部海马CA1区自发突触后电流的影响，以揭示远志皂苷对神经细胞突触传递调控作用和机理，从而满足科研和药物开发的试验需求，同时也能够为神经细胞的信号传递机理作出进一步的研究。

为解决上述问题，本发明采用技术方案为：远志皂苷对大鼠海马神经元突触传递的作用的试验方法， 

该试验方法使用的药品与试剂：

人工脑脊液 ，即ACSF，其组分是：NaCl为 124 mmol/L、KCl为 2.5 mmol/L、NaHCO₃ 为26 mmol/L、NaH₂PO₄ 为1.25 mmol/L、CaCl₂ 为2. 0 mmol/L、MgSO₄ 为1.3 mmol/L、D-葡萄糖为10 mmol/L，pH值为 7.4；

记录自发突触后电流的电极内液，其组分是：KCl 为140 mmol/L、NaCl为6 mmol/L、HEPES为10 mmol/L、EGTA为10 mmol/L、Mg-ATP为2 mmol/L、NaGTP为0.1 mmol/L、pH值为7.2；

 记录自发兴奋性突触后电流的电极内液，其组分是：K gluconate 为140 mmol/L、NaCl 为6 mmol/L、HEPES 为10 mmol/L、EGTA 为0.2 mmol/L、Mg-ATP 为2 mmol/L、Na-GTP 为0.1 mmol/L、pH 值为7.2；

记录自发抑制性突触后电流的电极内液，其组分是：KF为 140 mmol/L、NaCl 为6 mmol/L、HEPES 为10 mmol/L、EGTA 为0.2 mmol/L、Mg-ATP 为2 mmol/L、Na-GTP 为0.1 mmol/L、pH 值为7.2；

试验用药： CNQX、DL-APV、tetrodotoxin 即TTX、bicuculline即BM、远志皂苷即TEN；

CNQX、DL-APV、bicuculline即BM、tetrodotoxin 即TTX 、HEPES 、EGTA 、Mg-ATP 、Na-GTP、potassium gluconate、KF均购自美国Sigma公司，远志皂苷即TEN由实验室制备，其余试剂均为国产分析纯试剂；

CNQX，英文全称：6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione，中文全称：6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮，是神经兴奋性递质谷氨酸AMPA受体拮抗剂，分子为232.15；

DL-APV，英文全称：DL-2 -amino-5-phosphonovaleric acid，中文全称：DL-2-氨基-5-膦酰基缬草酸，是神经兴奋性递质谷氨酸NMDA受体拮抗剂，分子量为197.13；

bicuculline即BM，英文全称：bicuculline，中文通俗名：荷包牡丹碱，是抑制性神经递质γ-氨基丁酸GABA受体阻断剂，分子量367.35；

tetrodotoxin 即TTX，英文全称：tetrodotoxin，中文通俗名：河豚毒素，是细胞膜Na⁺离子通道阻断剂，分子量：319.27；

HEPES，英文名4-(2-hydroxyerhyl)piperazine-1-erhanesulfonic acid ，中文全称：4-羟乙基哌嗪乙磺酸，分子量为238.3；

EGTA，英文名称为Ethylene Glycol Bis(2-aminoethyl Ether)-N,N,N',N'-tetraacetic Acid，中文名称为乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸，分子量为380.35；

Mg-ATP ，英文名称Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt  ，中文名称：5′-三磷酸腺苷 (ATP) 镁盐，一种细胞能量补充试剂，可维持细胞状态，分子量：507.18；

Na-GTP，英文名称Guanosine 5′-triphosphate sodium salt ，中文名称5′-三磷酸鸟苷三钠三磷酸鸟苷三钠 钠盐，一种细胞能量补充试剂，可维持细胞状态，分子量：523.18；

potassium gluconate ，英文全称：potassium gluconate，中文全称：葡萄糖酸钾，分子量：234.25；

KF，英文全称：Potassium fluoride，中文全称：氟化钾，分子量：58.1。

大鼠海马脑片：厚度为400μm的大鼠海马半脑的海马脑片；

海马脑片的制备方式为：选用20~30d的健康SD大鼠，快速断头，用刀片切取出海马半脑；迅速将海马半脑粘于切片机载物台上，置入有0~4℃冰水ACSF (其中95% O₂和5% CO₂饱和状态)的切片槽中；利用振动式切片机 (Vibroslice品牌，英国制造) 切出400μm厚度的海马脑片；将脑片转至35℃孵育槽孵育1 h，然后室温继续孵育1 h，孵育槽中为95% O₂和5% CO₂饱和的人工脑脊液。孵育后得到试验用海马脑片。

所述试验方法的试验步骤为：

（1）组装调试设备：记录槽内放置海马脑片，恒流泵通过出入水管使用人工脑脊液对记录槽进行持续灌注循环，流速为2 ml/min，循环液体积为50 ml，记录槽内的人工脑脊液体积为4ml；试验温度为室温20~25℃进行；

循环泵配套有100ml的烧杯，烧杯内盛放循环液即人工脑脊液，试验中加药时即将药物加在烧杯内，循环泵将烧杯内的人工脑脊液与记录槽内的人工脑脊液进行循环，通过人工脑脊液的循环将药物循环到记录槽内对海马脑片进行药物作用。

利用拉制仪将硅硼玻璃管拉制成实验用记录电极，电极电阻为2~5 MΩ；拉制仪型号Puller-87，美国制造；硅硼玻璃管的制造商为美国Borosilicate，硅硼玻璃管的内径为1.5 mm。

按照图1所示的方式将试验设备进行组装，记录电极的一端安装在电极夹持器内，记录电极的尖端插入记录槽内，并与海马脑片接触；电极夹持器上设有微操控制仪；记录电极通过线路放大器连接，放大器通过线路和模数转换器与电脑连接；记录槽上方还设有用于观察和辅助微操控制仪操作的显微镜，显微镜通过信号线路与电脑连接；

电刺激脉冲的给出及电信号的采集均通过计算机程序Clampx9.2和电脑的digidata 1320A接口完成；信号采样频率为10 kHz，低通Bessel滤波频率为2 kHz；在实验中持续监测输入电阻Ri和串行电阻 Ra的阻值，Ri在100~300 MΩ之间，Ra≤20 MΩ； 

输入电阻Ri和串行电阻 Ra的阻值均由膜片钳放大器监控，其电阻值通过数据转换会显示在计算机clampx9.2R 程序界面上，Ri 主要代表的是形成全细胞后，整一个细胞膜的电阻，其电阻值变化的大小主要反应的是细胞的状态变化以及记录电极尖端与细胞的封接状态，如果Ri变小，且幅度超过原来的30%以上，提示细胞状态变差或是电极与细胞的封接状态不好，这种状态下记录到的数据就会跟原来的数据造成很大的误差。Ra指的是形成全细胞膜片钳记录模式后，电极尖端和电极本身的电阻，如果Ra变大，代表着在形成全细胞记录模式后，原来被吸破的那片膜可能又发生了回堵，使电极尖端与细胞之间的电阻又增大了，使的原来良好的全细胞记录状态发生了变化，形成了不完全破膜，这种情况下所记录到数据误差也是很大的。在试验过程中通过对两个阻值的监测，能够监视神经细胞电流监测的准确性，确保试验结果的准确。

（2）形成全细胞记录模式：在显微镜和微操控制仪的辅助下，将记录电极的尖端靠近细胞并接触，形成细胞贴附式记录模式，随后给记录电极施加一个负压，使电极尖端与细胞贴附部位的细胞膜破裂，使记录电极端部与细胞内部形成全细胞记录模式；随后通过电压钳制的方式将细胞膜电位钳制在试验所需的特定数值范围；此时，细胞本身产生相应的自发放电流；

（3）记录神经元自发突触后电流即sPSC 的试验操作过程：使用记录自发突触后电流的电极内液充入记录电极的管体内部，记录槽内循环的人工脑脊液为4ml，然后向循环泵的循环液即人工脑脊液内加入药物远志皂苷；

将全细胞记录模式下的细胞的膜电位钳制在-80mV，在全细胞信号记录获得稳定的基线后，进行数据采样并持续记录5min；

该步骤中的远志皂苷直接溶解到人工脑脊液内，然后通过循环泵进行不同药物浓度的给药实验，远志皂苷生药浓度为0.5 g/L、1 g/L、1.5 g/L、2 g/L 四种不同的浓度，四个药物浓度下进行四组试验，每组试验均进行8个试验循环，试验循环的个数即为实验样本数；并在四种药物浓度下分别记录四组试验中神经元自发突触后电流的信号数据；

所述试验循环为：包括给药前阶段、给药阶段和药物洗脱阶段；给药前阶段采用循环泵将烧杯中不含TEN药液的人工脑脊液与记录槽进行循环，此时细胞处于不含药液的人工脑脊液中，此时测得的细胞信号数据称为控制组数据；

给药阶段：将试验的含有远志皂苷药液的人工脑脊液加入烧杯内，通过循环泵将含有药液的人工脑脊液循环泵入记录槽内，神经细胞受到远志皂苷药物的作用，此时测得的细胞信号数据称为药物组数据；

药物洗脱阶段：将烧杯内的人工脑脊液更换为不含远志皂苷药液的人工脑脊液，通过循环泵将记录槽内的药液与人工脑脊液置换出去，细胞处于无药液的人工脑脊液中，此时测得的细胞信号数据称为恢复组数据；

每个试验循环结束进行下一个给药实验均需要更换新的海马脑片；

神经元自发突触后电流的试验结果如图3、图4、图5、图6所示，图中的Control数据为给药前阶段的控制组数据，图中的TEN数据为给药阶段的药物组数据，图中的Recovery数据为药物洗脱阶段的恢复组数据；远志皂苷对海马脑片CA1区锥体神经元自发突触后电流（sPSC）频率及幅度的影响。图3、图4为实验过程中所记录到的sPSC在给药前，给药过程中（1.5g/L的TEN浓度），以及药物洗脱后的原始sPSC的变化图。图5为给药前后sPSC的幅度累积分布图(数据来自于图3、图4的原始图数据)，采用KS检验分析发现，给药前后的sPSC的幅度累积分布具有显著性差异。并且这种差异性在所有的6例细胞实验中均很明显。图6中远志皂苷可以明显增加sPSC的频率，并且这种增加作用呈现一种浓度依赖性。此实验过程中，膜电位一直钳制在-80mV。

该步骤的试验结果表明，1.5g/L 生药浓度的 TEN对sPSC的发放具有明显的促进作用，显著增加sPSC的频率达310.25%±44.19%（p<0.01），并能明显增加电流发放的幅度；在图3、图4、图5中，TEN使该神经元发放频率增加到288.10%；电流幅度也明显增加 (KS检验，p<0.01)。此外，TEN对sPSC的促进作用在一定程度上呈现一定的剂量依赖性，当浓度达到2.0g/L生药浓度时，其促进作用达到饱和。

（4）记录神经元自发兴奋性突触后电流即sEPSC的试验操作过程：使用记录自发兴奋性突触后电流的电极内液充入记录电极的管体内部，进行8个试验循环检测sEPSC的变化数据；

所述试验循环为：包括给药前阶段、给药阶段和药物洗脱阶段；给药前阶段采用循环泵将烧杯中含有药物BM的人工脑脊液与记录槽进行循环，此时测得的细胞信号数据称为控制组数据；人工脑脊液中的BM浓度为20μmol/L；

给药阶段：将试验的含有远志皂苷生药浓度为1.5 g/L、BM浓度为20μmol/L的人工脑脊液加入烧杯内，通过循环泵将含有药液的人工脑脊液循环泵入记录槽内，神经细胞受到远志皂苷药物的作用，此时测得的细胞信号数据称为药物组数据；

药物洗脱阶段：将烧杯内的人工脑脊液更换为含有BM浓度为20μmol/L的人工脑脊液，通过循环泵将记录槽内的药液与人工脑脊液置换出去，细胞处于只含有BM的人工脑脊液中，此时测得的细胞信号数据称为恢复组数据；

每个试验循环结束进行下一个给药实验均需要更换新的海马脑片；

每个试验循环将全细胞记录模式下的细胞的膜电位钳制在-70mV，在全细胞信号记录获得稳定的基线后，进行数据采样并持续记录5min；

神经元自发兴奋性突触后电流的试验结果，如图7、图8、图9所示，图中的Control数据为给药前阶段的控制组数据，图中的TEN数据为给药阶段的药物组数据，图中的Recovery数据为药物洗脱阶段的恢复组数据；远志皂苷对海马脑片CA1区锥体神经元自发兴奋性突触后电流（sEPSC）频率及幅度的影响。图7为实验过程中所记录到的sEPSC在给药前，给药过程中（TEN生药浓度1.5g/L），以及药物洗脱后的原始变化图。图8中，远志皂苷可以明显增加sEPSC的频率(记录样本为8组数据)。图9为给药前后sPSC的幅度累积分布图，采用KS检验分析发现，给药前后的sEPSC的幅度累积分布具有显著性差异。此实验过程中，膜电位一直钳制在-70mV。

该步骤的试验结果表明，在ACSF中加入BM (控制人工脑脊液中浓度为20μmol/L)后记录sEPSC，在形成全细胞记录后，把膜电位钳制在-70mV，此时所记录的向下的自发内向离子电流可被AMPA受体拮抗剂CNQX (20μmol/L) 完全阻断，证明此电流为AMPA受体所介导的自发兴奋性突触后电流sEPSC，由图7至图9可知，TEN对sEPSC的发放具有明显的促进作用，显著增加sEPSC的频率达237.25%±44.11%（p<0.01），并能明显增加电流发放的幅度 (p<0.01)。

（5）记录神经元自发抑制性突触后电流sIPSC的试验操作过程：使用记录自发抑制性突触后电流的电极内液充入记录电极的管体内部，进行6个试验循环检测sIPSC的变化数据；

所述试验循环为：包括给药前阶段、给药阶段和药物洗脱阶段；给药前阶段采用循环泵将烧杯中含有药物CNQX和DL-APV的人工脑脊液与记录槽进行循环，此时测得的细胞信号数据称为控制组数据；人工脑脊液中CNQX的浓度为20μmol/L、DL-APV的浓度为50μmol/L；

给药阶段：将试验的含有远志皂苷生药浓度为1.5 g/L、CNQX浓度为20μmol/L、DL-APV浓度为50μmol/L的人工脑脊液加入烧杯内，通过循环泵将含有药液的人工脑脊液循环泵入记录槽内，神经细胞受到远志皂苷药物的作用，此时测得的细胞信号数据称为药物组数据；

药物洗脱阶段：将烧杯内的人工脑脊液更换为含有CNQX的浓度为20μmol/L、DL-APV的浓度为50μmol/L的人工脑脊液，通过循环泵将记录槽内的药液与人工脑脊液置换出去，细胞处于只含有CNQX和DL-APV的人工脑脊液中，此时测得的细胞信号数据称为恢复组数据；

每个试验循环结束进行下一个给药实验均需要更换新的海马脑片；

每个试验循环将全细胞记录模式下的细胞的膜电位钳制在-10mV，在全细胞信号记录获得稳定的基线后，进行数据采样并持续记录5min；

图10、图11和图12表明远志皂苷对海马脑片CA1区锥体神经元自发抑制性突触后电流（sIPSC）频率及幅度的影响。图中的Control数据为给药前阶段的控制组数据，图中的TEN数据为给药阶段的药物组数据，图中的Washout数据为药物洗脱阶段的恢复组数据；图10为实验过程中所记录到的sIPSC在给药前，给药过程中（TEN浓度1.5g/L），以及药物洗脱后的原始变化图。图11为远志皂苷对sIPSC的频率(记录样本为6组细胞数据)不具有明显的影响作用。图12为给药前后sPSC的幅度累积分布图，采用KS检验分析发现，给药前后的sIPSC的幅度累积分布不具有显著性差异。此实验过程中，膜电位一直钳制在-10mV。

该步骤的试验结果为：在ACSF中加入Glu受体拮抗剂CNQX (20μmol/L)、DL-APV (50μmol/L) 后记录sIPSC，在形成全细胞记录后，把膜电位钳制在-10mV，此时所记录的向上的自发外向离子电流可被BM (20μmol/L) 完全阻断，证明此电流为GABAA受体所介导的自发抑制性突触后电流sIPSC，由图10、图11、图12可知，TEN对sIPSC的发放不具有明显的影响，给药后sIPSC的频率93.01%±4.56%（p>0.05），对电流发放的幅度也不具有明显的影响 (p>0.05)。

（6）记录神经元自发微小兴奋性突触后电流即mEPSC的试验操作过程，进行6个试验循环检测mEPSC的变化数据；

所述试验循环为：包括给药前阶段、给药阶段和药物洗脱阶段；给药前阶段采用循环泵将烧杯中含有药物BM和 TTX的人工脑脊液与记录槽进行循环，此时测得的细胞信号数据称为控制组数据；人工脑脊液中的BM浓度为20μmol/L，TTX的浓度为1μmol/L；

给药阶段：将试验的含有远志皂苷生药浓度为1.5 g/L、BM浓度为20μmol/L，TTX的浓度为1μmol/L的人工脑脊液加入烧杯内，通过循环泵将含有药液的人工脑脊液循环泵入记录槽内，神经细胞受到远志皂苷药物的作用，此时测得的细胞信号数据称为药物组数据；

药物洗脱阶段：将烧杯内的人工脑脊液更换为含有BM浓度为20μmol/L、TTX的浓度为1μmol/L的人工脑脊液，通过循环泵将记录槽内的药液与人工脑脊液置换出去，细胞处于只含有BM和TTX的人工脑脊液中，此时测得的细胞信号数据称为恢复组数据；

每个试验循环结束进行下一个给药实验均需要更换新的海马脑片；

每个试验循环将全细胞记录模式下的细胞的膜电位钳制在-70mV，在全细胞信号记录获得稳定的基线后，进行数据采样并持续记录5min；

如图13、图14、图15所示为远志皂苷对海马脑片CA1区锥体神经元自发兴奋性突触后微电流（mEPSC）频率及幅度的影响。图中的Control数据为给药前阶段的控制组数据，图中的TEN数据为给药阶段的药物组数据，图中的Recovery数据为药物洗脱阶段的恢复组数据；图13为实验过程中所记录到的mEPSC在给药前，给药过程中（TEN浓度为1.5g/L），以及药物洗脱后的原始变化图。图14为远志皂苷对mEPSC的频率(记录样本为8组细胞数据)具有明显的增强作用。图15为给药前后mPSC的幅度累积分布图，采用KS检验分析发现，给药前后mEPSC的幅度累积分布不具有显著性差异。此实验过程中，膜电位一直钳制在-70mV。

该步骤的试验结果为，在ACSF中加入BM (20μmol/L)、TTX (1μmol/L) 后记录mEPSC，在形成全细胞记录后，把膜电位钳制在-70mV，此时所记录的向下的自发内向离子电流幅度及频率明显小于sEPSC，此电流也可被AMPA受体拮抗剂CNQX(浓度为20μmol/L) 完全阻断，证明此电流为AMPA受体所介导的自发微兴奋性突触后电流mEPSC (未显示结果)，由图4可知，TEN对mEPSC的发放具有明显的促进作用，显著增加mEPSC的频率达201.13%±25.43%（p<0.01），但对mEPSC电流发放的幅度没有明显的影响 (p>0.05)。

（7）统计分析：采用MiniAnalysis6.0对采集到的信号数据进行分析，采用Origin 8.0和corelDRAW作图；数据采用均数±标准差即                                               ±s的方式表示,组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义；使用Kolmogorov-Smirnov检验来比较各组间的电流幅度差异，P<0.05为差异有统计学意义。

本试验用远志皂苷的获取方法为：

如图2所示，取用1000g购于江西省南昌市中药材市场的远志，该远志为细叶远志；将远志粉碎，加石油醚进行脱脂；然后用95%乙醇回流提取3次，每次6h；将三次所得提取液合并，用旋转蒸发仪将提取液蒸干后得到浸膏；将浸膏复溶于3倍体积的水，进行过滤，将所得滤液采用乙酸乙酯萃取6次，前两次萃取的乙酸乙酯使用量为滤液总体积的1/3，第三次、第四次萃取的乙酸乙酯使用量为滤液总体积的1/4，第五次萃取的乙酸乙酯使用量为滤液总体积的1/5，第六次萃取的乙酸乙酯使用量为滤液总体积的1/6；然后将萃取液用大孔树脂吸附，再将萃取液分别用蒸馏水、30%乙醇、70%乙醇、95%乙醇进行洗脱，收集洗脱液后将其冷冻干燥，再使用70%乙醇洗脱液进行洗脱蒸干后得到试验用远志皂苷药品，最终获得远志皂苷41.96g，提取率为4.2%。

本试验方法的结果表明，TEN对海马CA1区神经元突触传递具有明显的促进作用，促进sPSC的发放频率并显著增大sPSC的电流发放幅度，且TEN的这种促进作用在一定程度上呈剂量依赖性。在对sPSC电流成份的进一步分离实验中发现，TEN能明显促进sEPSC的发放，表现在明显的增频及增幅作用。然而，TEN对sIPSC的发放则没有明显的影响。这一结果提示，TEN对海马CA1区锥体神经元突触传递的作用主要表现在对兴奋性突触传递的调控上，且这一调控作用与抑制性中间神经元无关。

CA3区锥体细胞发出的Schaffer侧支/联合纤维与CA1区锥体细胞形成递质为谷氨酸的兴奋性单突触联系，静息状态下，突触前膜释放的谷氨酸呈量子式释放到突触间隙，然后与突触后膜的相应受体如α-氨基-3-羟基-5-甲基恶唑-4-丙酸 (AMPA) 等受体结合引起去极化电流，即自发性兴奋性微突触后膜电流 (mEPSC)。也就是说, mEPSC反映兴奋性突触在静息状态下的自发活动。mEPSC的频率变化主要反映突触前谷氨酸释放量的多少，幅值变化主要与突触后膜受体特性有关。因此我们又进一步试验研究了TEN对海马CA1区锥体神经元mEPSC的影响。结果表明，TEN对mEPSC的发放具有明显的增频作用，而对mEPSC的电流发放幅度未产生明显影响。这说明TEN对兴奋性突触传递的促进作用主要是通过突触前机制实现的。

综上所述，TEN能促进突触传递作用，主要表现在对兴奋性突触传递的调控上，且这一调控是通过直接促进突触前谷氨酸释放量来实现的，与抑制性中间神经元的间接调控无关。

本发明的试验方法采用全细胞膜片钳技术研究远志皂苷对大鼠脑部海马CA1区自发突触后电流的影响，能够通过试验的方式准确揭示远志皂苷对神经细胞突触传递调控作用和机理，从而满足了科研和药物开发的试验需求，同时也能够为神经细胞的信号传递机理作出进一步的研究。

本发明的试验方法采用不同的药物对神经细胞进行试验数据的采集，并且采集多组数据进行科学的分析，能够得出科学的、令人信服的试验数据和分析结果。

本发明的试验方法，采用微操控制仪和显微镜配合，进行神经细胞的全细胞记录模式操作，具有非常精确的操作度，确保了试验数据采集的准确性和试验结果的精确度。

本发明的试验方法，采集的分析数据具有较高的准确性，对于试验数据的分析得出的科学、准确的分析结果，因此，本发明的试验方法和设备能够满足科学研究和试验的要求，试验方法的设计科学有效。

本发明的试验方法，每个试验中采用多个试验循环获得多个样本数据，每个试验循环采用新的海马脑片和药液进行试验，确保了试验结果的准确性。

附图说明

图1为本发明的试验设备组装结构图。

图2为本发明远志皂苷提取方法的流程图。

图3为本发明神经元自发突触后电流试验的给药过程中原始sPSC的变化图。

图4为本发明神经元自发突触后电流试验的给药前、给药过程中、药物洗脱后的原始sPSC的变化图。

图5为本发明神经元自发突触后电流试验的给药前后sPSC的幅度累积分布图。

图6为本发明神经元自发突触后电流试验的sPSC在不同远志皂苷浓度作用下的频率变化图。

图7为本发明神经元自发兴奋性突触后电流试验的给药前、给药过程中、药物洗脱后的原始sEPSC的变化图。

图8为本发明神经元自发兴奋性突触后电流试验的sEPSC的频率变化图。

图9为本发明神经元自发兴奋性突触后电流试验的给药前后sEPSC的幅度累积分布图。

图10为本发明神经元自发抑制性突触后电流试验的给药前、给药过程中、药物洗脱后的原始sIPSC的变化图。

图11为本发明神经元自发抑制性突触后电流试验的sIPSC的频率变化图。

图12为本发明神经元自发抑制性突触后电流试验的给药前后sIPSC的幅度累积分布图。

图13为本发明神经元自发微小兴奋性突触后电流试验的给药前、给药过程中、药物洗脱后的原始mEPSC的变化图。

图14为本发明神经元自发微小兴奋性突触后电流试验的mEPSC的频率变化图。

图15为本发明神经元自发微小兴奋性突触后电流试验的给药前后mEPSC的幅度累积分布图。

具体实施方式

下列实施例将进一步说明本发明。

实施例1

本发明采用技术方案为远志皂苷对大鼠海马神经元突触传递的作用的试验方法，该试验方法使用的药品与试剂：

人工脑脊液 ，即ACSF，其组分是：NaCl为 124 mmol/L、KCl为 2.5 mmol/L、NaHCO₃ 为26 mmol/L、NaH₂PO₄ 为1.25 mmol/L、CaCl₂ 为2. 0 mmol/L、MgSO₄ 为1.3 mmol/L、D-葡萄糖为10 mmol/L，pH值为 7.4；

记录自发突触后电流的电极内液，其组分是：KCl 为140 mmol/L、NaCl为6 mmol/L、HEPES为10 mmol/L、EGTA为10 mmol/L、Mg-ATP为2 mmol/L、NaGTP为0.1 mmol/L、pH值为7.2；

 记录自发兴奋性突触后电流的电极内液，其组分是：K gluconate 为140 mmol/L、NaCl 为6 mmol/L、HEPES 为10 mmol/L、EGTA 为0.2 mmol/L、Mg-ATP 为2 mmol/L、Na-GTP 为0.1 mmol/L、pH 值为7.2；

记录自发抑制性突触后电流的电极内液，其组分是：KF为 140 mmol/L、NaCl 为6 mmol/L、HEPES 为10 mmol/L、EGTA 为0.2 mmol/L、Mg-ATP 为2 mmol/L、Na-GTP 为0.1 mmol/L、pH 值为7.2；

试验用药： CNQX、DL-APV、tetrodotoxin 即TTX、bicuculline即BM、远志皂苷即TEN；

CNQX、DL-APV、bicuculline即BM、tetrodotoxin 即TTX 、HEPES 、EGTA 、Mg-ATP 、Na-GTP、potassium gluconate、KF均购自美国Sigma公司，远志皂苷即TEN由实验室制备，其余试剂均为国产分析纯试剂；

CNQX，英文全称：6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione，中文全称：6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮，是神经兴奋性递质谷氨酸AMPA受体拮抗剂，分子为232.15；

DL-APV，英文全称：DL-2 -amino-5-phosphonovaleric acid，中文全称：DL-2-氨基-5-膦酰基缬草酸，是神经兴奋性递质谷氨酸NMDA受体拮抗剂，分子量为197.13；

bicuculline即BM，英文全称：bicuculline，中文通俗名：荷包牡丹碱，是抑制性神经递质γ-氨基丁酸GABA受体阻断剂，分子量367.35；

tetrodotoxin 即TTX，英文全称：tetrodotoxin，中文通俗名：河豚毒素，是细胞膜Na⁺离子通道阻断剂，分子量：319.27；

HEPES，英文名4-(2-hydroxyerhyl)piperazine-1-erhanesulfonic acid ，中文全称：4-羟乙基哌嗪乙磺酸，分子量为238.3；

EGTA，英文名称为Ethylene Glycol Bis(2-aminoethyl Ether)-N,N,N',N'-tetraacetic Acid，中文名称为乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸，分子量为380.35；

Mg-ATP ，英文名称Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt  ，中文名称：5′-三磷酸腺苷 (ATP) 镁盐，一种细胞能量补充试剂，可维持细胞状态，分子量：507.18；

Na-GTP，英文名称Guanosine 5′-triphosphate sodium salt ，中文名称5′-三磷酸鸟苷三钠三磷酸鸟苷三钠 钠盐，一种细胞能量补充试剂，可维持细胞状态，分子量：523.18；

potassium gluconate ，英文全称：potassium gluconate，中文全称：葡萄糖酸钾，分子量：234.25；

KF，英文全称：Potassium fluoride，中文全称：氟化钾，分子量：58.1。

大鼠海马脑片：厚度为400μm的大鼠海马半脑的海马脑片；

海马脑片的制备方式为：选用20~30d的健康SD大鼠，快速断头，用刀片切取出海马半脑；迅速将海马半脑粘于切片机载物台上，置入有0~4℃冰水ACSF (其中95% O₂和5% CO₂饱和状态)的切片槽中；利用振动式切片机 (Vibroslice品牌，英国制造) 切出400μm厚度的海马脑片；将脑片转至35℃孵育槽孵育1 h，然后室温继续孵育1 h，孵育槽中为95% O₂和5% CO₂饱和的人工脑脊液。孵育后得到试验用海马脑片。

该试验方法的试验步骤为：

（1）组装调试设备：记录槽内放置海马脑片，恒流泵通过出入水管使用人工脑脊液对记录槽进行持续灌注，流速为2 ml/min，循环液体积为50 ml，记录槽内的人工脑脊液体积为4ml；试验温度为室温20~25℃进行；

利用拉制仪将硅硼玻璃管拉制成实验用记录电极，电极电阻为3 MΩ；记录电极的一端安装在电极夹持器内，记录电极的尖端插入记录槽内，并与海马脑片接触；电极夹持器上设有微操控制仪；记录电极通过线路放大器连接，放大器通过线路和模数转换器与电脑连接；记录槽上方还设有用于观察和辅助微操控制仪操作的显微镜，显微镜通过信号线路与电脑连接；

电刺激脉冲的给出及电信号的采集均通过计算机程序Clampx9.2和电脑的digidata 1320A接口完成；信号采样频率为10 kHz，低通Bessel滤波频率为2 kHz；在实验中持续监测输入电阻Ri和串行电阻 Ra的阻值，Ri在100~300 MΩ之间，Ra≤20 MΩ； 

（2）形成全细胞记录模式：在显微镜和微操控制仪的辅助下，将记录电极的尖端靠近细胞并接触，形成细胞贴附式记录模式，随后给记录电极施加一个负压，使电极尖端与细胞贴附部位的细胞膜破裂，使记录电极端部与细胞内部形成全细胞记录模式；随后通过电压钳制的方式将细胞膜电位钳制在试验所需的特定数值范围；此时，细胞本身产生相应的自发放电流；

（3）记录神经元自发突触后电流即sPSC 的试验操作过程：使用记录自发突触后电流的电极内液充入记录电极的管体内部，记录槽内循环的人工脑脊液为4ml，然后向循环泵的循环液即人工脑脊液内加入药物远志皂苷；

将全细胞记录模式下的细胞的膜电位钳制在-80mV，在全细胞信号记录获得稳定的基线后，进行数据采样并持续记录5min；

该步骤中的远志皂苷直接溶解到人工脑脊液内，然后通过循环泵进行不同药物浓度的给药实验，远志皂苷生药浓度为0.5 g/L、1 g/L、1.5 g/L、2 g/L 四种不同的浓度，四个药物浓度下进行四组试验，每组试验均进行8个试验循环，试验循环的个数即为实验样本数；并在四种药物浓度下分别记录四组试验中神经元自发突触后电流的信号数据；

所述试验循环为：包括给药前阶段、给药阶段和药物洗脱阶段；给药前阶段采用循环泵将烧杯中不含TEN药液的人工脑脊液与记录槽进行循环，此时细胞处于不含药液的人工脑脊液中，此时测得的细胞信号数据称为控制组数据；

给药阶段：将试验的含有远志皂苷药液的人工脑脊液加入烧杯内，通过循环泵将含有药液的人工脑脊液循环泵入记录槽内，神经细胞受到远志皂苷药物的作用，此时测得的细胞信号数据称为药物组数据；

药物洗脱阶段：将烧杯内的人工脑脊液更换为不含远志皂苷药液的人工脑脊液，通过循环泵将记录槽内的药液与人工脑脊液置换出去，细胞处于无药液的人工脑脊液中，此时测得的细胞信号数据称为恢复组数据；

每个试验循环结束进行下一个给药实验均需要更换新的海马脑片；

（4）记录神经元自发兴奋性突触后电流即sEPSC的试验操作过程：使用记录自发兴奋性突触后电流的电极内液充入记录电极的管体内部，进行8个试验循环检测sEPSC的变化数据；

所述试验循环为：包括给药前阶段、给药阶段和药物洗脱阶段；给药前阶段采用循环泵将烧杯中含有药物BM的人工脑脊液与记录槽进行循环，此时测得的细胞信号数据称为控制组数据；人工脑脊液中的BM浓度为20μmol/L；

给药阶段：将试验的含有远志皂苷生药浓度为1.5 g/L、BM浓度为20μmol/L的人工脑脊液加入烧杯内，通过循环泵将含有药液的人工脑脊液循环泵入记录槽内，神经细胞受到远志皂苷药物的作用，此时测得的细胞信号数据称为药物组数据；

药物洗脱阶段：将烧杯内的人工脑脊液更换为含有BM浓度为20μmol/L的人工脑脊液，通过循环泵将记录槽内的药液与人工脑脊液置换出去，细胞处于只含有BM的人工脑脊液中，此时测得的细胞信号数据称为恢复组数据；

每个试验循环结束进行下一个给药实验均需要更换新的海马脑片；

每个试验循环将全细胞记录模式下的细胞的膜电位钳制在-70mV，在全细胞信号记录获得稳定的基线后，进行数据采样并持续记录5min；

（5）记录神经元自发抑制性突触后电流sIPSC的试验操作过程：使用记录自发抑制性突触后电流的电极内液充入记录电极的管体内部，进行6个试验循环检测sIPSC的变化数据；

所述试验循环为：包括给药前阶段、给药阶段和药物洗脱阶段；给药前阶段采用循环泵将烧杯中含有药物CNQX和DL-APV的人工脑脊液与记录槽进行循环，此时测得的细胞信号数据称为控制组数据；人工脑脊液中CNQX的浓度为20μmol/L、DL-APV的浓度为50μmol/L；

给药阶段：将试验的含有远志皂苷生药浓度为1.5 g/L、CNQX浓度为20μmol/L、DL-APV浓度为50μmol/L的人工脑脊液加入烧杯内，通过循环泵将含有药液的人工脑脊液循环泵入记录槽内，神经细胞受到远志皂苷药物的作用，此时测得的细胞信号数据称为药物组数据；

药物洗脱阶段：将烧杯内的人工脑脊液更换为含有CNQX的浓度为20μmol/L、DL-APV的浓度为50μmol/L的人工脑脊液，通过循环泵将记录槽内的药液与人工脑脊液置换出去，细胞处于只含有CNQX和DL-APV的人工脑脊液中，此时测得的细胞信号数据称为恢复组数据；

每个试验循环结束进行下一个给药实验均需要更换新的海马脑片；

每个试验循环将全细胞记录模式下的细胞的膜电位钳制在-10mV，在全细胞信号记录获得稳定的基线后，进行数据采样并持续记录5min；

（6）记录神经元自发微小兴奋性突触后电流即mEPSC的试验操作过程，进行6个试验循环检测mEPSC的变化数据；

所述试验循环为：包括给药前阶段、给药阶段和药物洗脱阶段；给药前阶段采用循环泵将烧杯中含有药物BM和 TTX的人工脑脊液与记录槽进行循环，此时测得的细胞信号数据称为控制组数据；人工脑脊液中的BM浓度为20μmol/L，TTX的浓度为1μmol/L；

给药阶段：将试验的含有远志皂苷生药浓度为1.5 g/L、BM浓度为20μmol/L，TTX的浓度为1μmol/L的人工脑脊液加入烧杯内，通过循环泵将含有药液的人工脑脊液循环泵入记录槽内，神经细胞受到远志皂苷药物的作用，此时测得的细胞信号数据称为药物组数据；

药物洗脱阶段：将烧杯内的人工脑脊液更换为含有BM浓度为20μmol/L、TTX的浓度为1μmol/L的人工脑脊液，通过循环泵将记录槽内的药液与人工脑脊液置换出去，细胞处于只含有BM和TTX的人工脑脊液中，此时测得的细胞信号数据称为恢复组数据；

每个试验循环结束进行下一个给药实验均需要更换新的海马脑片；

每个试验循环将全细胞记录模式下的细胞的膜电位钳制在-70mV，在全细胞信号记录获得稳定的基线后，进行数据采样并持续记录5min；

（7）统计分析：采用MiniAnalysis6.0对采集到的信号数据进行分析，采用Origin 8.0和corelDRAW作图；数据采用均数±标准差即±s的方式表示,组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义；使用Kolmogorov-Smirnov检验来比较各组间的电流幅度差异，P<0.05为差异有统计学意义。

本试验用远志皂苷的获取方法为：

取用1000g购于江西省南昌市中药材市场的远志，该远志为细叶远志；将远志粉碎，加石油醚进行脱脂；然后用95%乙醇回流提取3次，每次6h；将三次所得提取液合并，用旋转蒸发仪将提取液蒸干后得到浸膏；将浸膏复溶于3倍体积的水，进行过滤，将所得滤液采用乙酸乙酯萃取6次，前两次萃取的乙酸乙酯使用量为滤液总体积的1/3，第三次、第四次萃取的乙酸乙酯使用量为滤液总体积的1/4，第五次萃取的乙酸乙酯使用量为滤液总体积的1/5，第六次萃取的乙酸乙酯使用量为滤液总体积的1/6；然后将萃取液用大孔树脂吸附，再将萃取液分别用蒸馏水、30%乙醇、70%乙醇、95%乙醇进行洗脱，收集洗脱液后将其冷冻干燥，再使用70%乙醇洗脱液进行洗脱蒸干后得到试验用远志皂苷药品，最终获得远志皂苷41.96g，提取率为4.2%。

本实施例的试验数据见图3至图15部分，试验数据的分析结果见说明书的发明内容部分的数据分析。

最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。