肾脏近曲小管多巴胺D受体对内皮素B受体的异常调节在原发性高血压发病中的作用研究

摘要

一、研究背景 肾脏由于其对尿钠重吸收的调节作用而在血压调控中发挥重要作用。在肾脏的各个部位中，肾脏近曲小管(RPT)的作用尤其引人注目。它可调控超滤液中约70％的Na+、Cl-和水、100％的葡萄糖和氨基酸。在RPT，由于上皮细胞基底膜的Na+-K+-ATP酶的作用，使小管液与胞浆之间的Na+维持一定的浓度阶差，从而为水和钠的重吸收提供了原动力。因此，在某些情况下，如果引起了Na+-K+-ATP酶的活性增强，意味着水和钠的重吸收增加，最终将导致机体水钠潴留，血压增高。 肾脏的尿钠排泄受到多个神经体液系统的调节，多巴胺与内皮素系统在调节水盐平衡中的作用得到人们的重视。肾小管能够分泌内皮素(ET)，并且通过自分泌或旁分泌的形式参与调节离子的转运。许多在体及离体实验结果显示内皮素对水钠重吸收的调节作用主要通过内皮素B(ETB)受体。在肾髓质，刺激ETB受体可通过抑制集合管的离子转运，从而达到调节水盐代谢的目的；然而，对于ETB受体在RPT段的作用却有不同的报道，短时间刺激OK(负鼠肾脏)细胞ETB受体可激活氢钠交换体-3(NHE3)的活性；长时间(6小时)刺激则抑制其表达及功能。我们的预实验发现ETB受体在RPT处表达丰富，因Na+-K+-ATP酶为此处水钠重吸收的原动力，我们推测该受体在RPT段可能通过对Na+-K+-ATP酶活性的影响，发挥着对离子转运的调控作用。 多巴胺受体分为D1-样(D1、D5)和D2-样(D2、D3、D4)两类受体亚型。以往研究发现D1受体可通过排钠利尿、扩张血管作用发挥对血压的调节功能。然而，人们对D2-样受体的研究尚少。D3受体为D2-样受体中主要的受体亚型，且D3受体在RPT的表达占主导地位。我们的初步研究显示多巴胺D3受体基因敲除小鼠的尿钠排泄功能障碍，伴有肾脏ETB受体的表达量减低，提示D3受体与ETB受体的相互作用可能在尿钠排泄中发挥一定的作用。鉴于自发性高血压大鼠(SHR)RPT处D3受体介导的尿钠排泄功能受损，我们推测在高血压状态下，D3受体与ETB受体间的交互作用同样存在受损现象，D3受体对ETB受体的异常调节可能参与了高血压的发病机制。我们将主要从细胞水平对此进行研究，此问题的解决对于完善原发性高血压(EH)的发病机制将会有一定的帮助，并为寻找有效的EH防治措施提供一种新的思路。 二、研究目的 1、明确D3和ETB受体在RPT细胞上的表达。 2、通过对Na+-K+-ATP酶活性的研究，观察ETB受体在肾脏RPT处对离子转运的调节功能，并深入寻找介导这一调节效应的信号转导途径。 3、研究D3受体对ETB受体的表达及功能的影响，探讨该调节作用在WKY(Wistar-Kyoto)及SHR大鼠上的区别，探索D3受体对ETB受体的异常调节在EH发生中的作用。 三、研究方法 1、本实验以WKY及SHR大鼠的RPT细胞株作为研究对象，采用激光共聚焦显微镜技术观察D3和ETB受体在RPT细胞上的表达情况。 2、以WKY大鼠的RPT细胞作为研究对象，观察刺激ETB受体对Na+-K+-ATP酶活性的影响，并观察在预先阻断蛋白激酶A(PKA)(PKA阻断剂14-22)、PKC(PKC阻断剂19-31)和Ca2+通道(Ca2+通道拮抗剂尼卡地平)的情况下ETB受体对Na+-K+-ATP酶活性影响的变化，探讨ETB受体作用的信号途径。 3、继续以RPT上皮细胞株为研究对象，观察刺激D3受体后ETB受体蛋白表达和功能的变化，D3受体蛋白表达的测定采用WesternBlot法；ETB受体调节离子转运功能的检测以其对Na+-K+-ATP酶活性的影响来反映，Na+-K+-ATP酶的活性测定采用哇巴因法检测单位时间内无机磷的产量。然后再进一步观察这一调节作用在SHR大鼠的RPT细胞上有无异常。 四、研究结果 1、D3和ETB受体在RPT细胞上均有丰富的表达，两种受体在RPT细胞上共存现象明显；但在SHR细胞这一共存程度明显降低。 2、刺激ETB受体能够明显降低Na+-K+-ATP酶的活性，这一抑制作用呈浓度和时间依赖性，BQ302010-8M刺激15min达最大效应，下降幅度约36.1％；进一步研究发现，这一效应的发生与细胞外钙离子内流有关，ETB受体与其特异性激动剂BQ3020结合后，经Gq激活细胞膜钙通道，使细胞外钙内流，进而激活PI3K-IP3-[Ca2+]i信号转导途径，从而发挥抑制Na+-K+-ATP酶活性的作用。 3、刺激D3受体增加WKY大鼠RPT细胞ETB受体的表达，却抑制SHR大鼠ETB受体的表达。用ETB受体激动剂BQ3020(10-8M/15min)刺激ETB受体可明显降低WKY大鼠RPT细胞的Na+-K+-ATP酶的活性，但在SHR的RPT细胞，这种抑制作用却丧失；基础状态下SHR的Na+-K+-ATP酶活性明显高于WKY大鼠。单独应用D3受体激动剂对Na+-K+-ATP酶活性无影响，预先刺激D3受体(PD128907，10-7M/24hrs)均可使ETB受体对Na+-K+-ATP酶活性的抑制作用进一步加强，但这种加强作用在SHR细胞明显弱于WKY细胞。 五、结论 1、ETB受体在RPT段通过降低Na+-K+-ATP酶活性参与离子转运的调节，这一抑制效应的发生与Ca2+信号转导途径有关：即ETB受体经Gq激活细胞膜钙通道，使细胞外钙内流，进而激活PI3K-IP3-[Ca2+]i途径，达到对Na+-K+-ATP酶活性的抑制作用。 2、D3受体通过对ETB受体蛋白表达的调节作用，从而调控ETB受体的钠泵调节功能，D3/ETB受体之间的异常调节参与了EH发生的机制。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩写一览表

声明

第一部分 RPT细胞的培养及多巴胺D3受体与内皮素B受体表达的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 内皮素B受体对肾脏近曲小管上皮细胞Na+-K+-ATP酶的调节及信号转导途径的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第三部分 原发性高血压大鼠肾脏近曲小管D3受体对内皮素B受体的表达及功能的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

全文总结

致谢

文献综述 多巴胺受体与其他血压调节系统的交互作用在高血压研究中的地位

攻读硕士学位期间发表论文