人脐血间充质干细胞成肌分化及对尿道括约肌功能影响的实验研究

摘要

女性压力性尿失禁(StressUrinaryIncontinence，SUI)是一种常见疾病，其发生率随妇女年龄的增加而增加，影响妇女的生活质量和身心健康。SUI发生的主要原因是尿道高移动性和尿道括约肌功能障碍。女性SUI的治疗方法虽多，但均难从根本上纠正尿道括约肌功能障碍。本课题拟利用基因工程技术将生肌调节因子Myocardin基因转染人脐血间充质干细胞(UB-MSCs)，并移植于SUI模型大鼠尿道括约肌周围，研究基因调控的UB-MSCs是否具有向平滑肌细胞分化的能力以及其在尿道括约肌周围存活、分布情况和对尿道括约肌功能的影响，为细胞移植治疗SUI提供理论依据。 主要实验结果和结论如下： 1.采用密度梯度离心法从脐血中分离培养出间充质干细胞(UB-MSCs)，并通过流式细胞仪对其表面抗原进行鉴定。UB-MSCs均稳定地表达相关的抗原标记CD29、CD44、CD105，但不表达造血细胞系的表面标记CD34、CD45，这与源于骨髓MSCs的表面抗原标记相一致。 2.构建了真核表达质粒载体pEGFP-Myocl。以pAdApt.Myocl为模板进行PCR和琼脂凝胶电泳，切胶回收纯化；反应产物经KpnⅠ和AgeⅠ双酶切后与线性化的载体用T4DNA连接酶连接，形成pEGFP-Myocl，将之转入工程菌JM109，铺板，挑选阳性克隆，摇菌，提取质粒。目的片段测序分析，与GeneBank报道序列完全一致。 3.应用脂质体转染的方法，将pEGFP-Myocl转入UB-MSCs中。转染后的细胞经G418筛选，转染效率为15.3％。转染后的MSCs用RT-PCR可检测出Myocardin的表达；荧光显微镜下观察可见胞体内有报告基因产物的绿色荧光；免疫组化检测Myocardin以及其下游蛋白myosin表达为阳性，而对照组为阴性表达。这说明UB-MSCs在Myocardin的调控下可诱导为成平滑肌细胞。 4.通过模拟产伤和卵巢切除成功制作SUI大鼠动物模型。对模型大鼠进行尿动力学检测，最大膀胱容量和漏点压均明显低于正常；HE染色可见近端尿道括约肌萎缩，肌纤维有断裂。 5.将转染Myocardin基因的UB-MSCs扩增后局部植入模型鼠尿道括约肌周围，通过Brdu法观察发现其可在注射点附近短时生长，并表达肌相关蛋白Desmin；通过尿动力学指标的统计分析，细胞移植后SUI模型鼠的控尿功能可以得到改善，但此效应是移植细胞对损伤的修复还是单纯的填充效应，还需进一步研究。 总之，本实验成功地构建了质粒载体pEGFP-Myocl，并将其成功地转染人UB-MSCs，使MSCs在Myocardin的调控下分化为成平滑肌细胞；并观察了向平滑肌分化的MSCs对SUI模型大鼠的尿道括约肌周围的分布、分化与生存情况以及对尿道括约肌功能的影响，初步探讨了细胞移植治疗SUI的可行性。本实验为SUI治疗的基础研究，旨在为SUI治疗提供新的思路。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写一览表

声明

前 言

第一部分人脐血间充质干细胞成肌诱导的实验研究

实验一人脐血间充质干细胞的分离、培养和鉴定

一、材 料

二、方 法

三、结 果

四、讨论

实验二 重组质粒pEGFP-Myocardin的构建

一、材 料

二、方 法

三、结 果

四、讨 论

实验三Myocardin诱导人脐血间充质干细胞成平滑肌细胞的实验研究

一、材 料

二、方 法

三、结 果

四、讨 论

第二部分成肌分化的人UB-MSCs对尿道括约肌功能影响的初步探讨

一、材 料

二、方 法

三、结 果

四、讨 论

全文结论

致 谢

照 片

参考文献

文献综述一 女性压力性尿失禁的注射治疗

文献综述二 脐血间充质干细胞的研究进展

在读期间撰写和发表的文章