siRNA干扰FPR后U87细胞裸鼠脑原位移植瘤生物学行为及血管生成特点改变及机制

摘要

近年来，趋化因子及其受体在恶性肿瘤的生长、侵袭以及转移中的作用越来越受重视。研究显示，一些表达在正常细胞的与特定生理或病理过程相关的趋化因子受体也可能表达于肿瘤细胞，而且在肿瘤演进中发挥作用。肿瘤演进是复杂的过程，涉及瘤细胞和宿主多方面、多阶段的相互作用。其中，瘤细胞的增殖和运动能力增强、释放蛋白水解酶增多、产生过多的促血管生成因子等重要改变，以及在瘤细胞与宿主相互作用过程中其调节紊乱是重要的研究内容，有关的受体也可能作为新的治疗措施的靶点。 FPR是吞噬细胞表达的一种G蛋白偶联受体，受内源性(如线粒体蛋白来源)或外源性(如细菌蛋白来源)配体N-甲酰化肽fMLF激活后使细胞趋化能力增强，并释放炎症介质，从而发挥免疫功能。最近研究发现，此受体也表达于恶性胶质瘤细胞，而且，体外激活可使瘤细胞运动能力增强，VEGF产生增多。恶性胶质瘤的特点是侵袭能力强，血管内皮增生活跃，容易出现坏死，而坏死物中的fMLF正好是FPR的激动剂，所以二者的存在和相互作用可能是恶性胶质瘤细胞增殖、侵袭和促血管生成的重要机制之一。 为研究恶性胶质瘤中FPR受体表达和激活在促进瘤细胞生长、侵袭与促血管生成中的作用和机制，本研究将已经成功地利用siRNA干扰了FPR的GBM细胞株U87应用于实验中，从以下三个方面进行了研究：(1)检测siRNA干扰FPR后的U87细胞(FPR-siRNA U87)的VEGF、MMP-2和-9蛋白表达以及相应配体fMLF激活后表达的改变：(2)观察siRNA干扰FPR后的U87细胞裸鼠脑原位移植瘤的生长、分化、侵袭和血管生成相关的形态学改变；(3)进一步检测siRNA干扰FPR后的U87细胞裸鼠脑原位移植瘤组织中VEGF、MMP-2和-9蛋白表达改变，同时检测胶质瘤分化标志物vimentin。主要结果和结论如下： 1.用转染了针对FPR构建的siRNA的U87细胞(FPR-siRNA U87)，以野生型U87细胞和Mock转染细胞(Mock)为对照进行体外培养，并用其已知最佳浓度(10.nmol/L)的特异性配体fMLF刺激，采用ELIsA方法检测培养6小时后细胞上清液中VEGF、MMP-2和-9蛋白含量，发现FPR-siRNA U87细胞VEGF表达显著低于对照细胞，且表达不象对照细胞一样受fMLF刺激影响。FPR-siRNA U87细胞MMP-9表达低于对照细胞，但与对照细胞一样，fMLF刺激后分泌改变不明显。而FPR-siRNA U87细胞的MMP-2表达却比未受fMLF刺激的对照细胞高，但Mock细胞受刺激后表达明显升高。这些结果说明VEGF表达与受体激活关系最为密切，而MMP-2和-9表达与受体表达有某种关系，但可能还受其它因素影响和调节，需要结合体内研究说明。 2.用免疫细胞化学方法检测FPR-siRNA U87细胞中VEGF蛋白和细胞膜上FPR受体表达，发现二者染色强度都比对照细胞者低。用RT-PCR检测上述条件下培养细胞的VEGF、MMP-2和-9的mRNA表达，发现FPR-siRNA U87细胞VEGF的mRNA表达出现与上清液中蛋白表达相似的改变趋势，而MMP-2和-9的mRNA表达在6小时未显示表达差异。这些结果同样说明VEGF表达与受体表达和激活关系密切，而MMP-2和-9表达可能还受其它因素影响和调节，包括转录后调节。 3.以野生型U87细胞和Mock细胞为对照，将FPR-siRNA U87细胞原位接种到裸鼠脑内，比较观察不同时间点(1w、2w、4w、5w及6w)移植瘤大小，光镜和电镜下观察其生长、分化、侵袭和促血管生成相关的形态学特点，发现FPR沉默后移植瘤生长明显较缓慢，没有对照细胞移植瘤在5w至6w出现的加速生长；细胞分化较高、核分裂像少、侵袭能力较弱，移植瘤中血管数明显较少，其形态和结构较接近正常。这些结果说明该受体体内表达和激活与恶性胶质瘤生长、分化、侵袭和促血管生成能力有关。 4.用Western blotting方法检测发现FPR-siRNA U87细胞裸鼠脑原位移植瘤组织中VEGF、MMP-2和-9蛋白表达下降，用免疫组化方法检测瘤组织中上述蛋白，发现VEGF和MMP-9蛋白表达明显降低。另外，vimentin染色明显减弱。这些结果进一步说明该受体表达和激活可通过介导或影响VEGF、MMP-2和-9表达，促进移植瘤侵袭和血管生成，还说明受体表达与裸鼠脑原位移植瘤细胞分化有关。 本研究说明，用siRNA沉默U87细胞的FPR可使细胞分化提高、增殖减慢，并通过下调MMP-2及-9和VEGF而削弱其侵袭和促血管生成能力，反过来说明该受体在恶性胶质瘤中的生长、侵袭和促血管生成中的作用，因而可作为抗胶质瘤治疗的很好靶点。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写一览表

声明

前 言

第一部分 siRNA干扰U87细胞FPR表达后VEGF、MMP-2和MMP-9表达改变

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

第二部分 siRNA干扰FPR对U87细胞裸鼠脑原位移植瘤生长、侵袭和血管生成的影响

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

第三部分 siRNA干扰FPR对U87细胞裸鼠脑原位移植瘤VEGF和MMP-2，-9表达的影响

材料与方法

结 果

讨 论

小结

全文结论

致 谢

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参考文献

文献综述一 甲酰化肽受体及其与肿瘤关系的研究进展

文献综述二 胶质母细胞瘤的坏死特点与血管生成

博士期间完成的论文和综述目录