乳香胶抗幽门螺杆菌成份活性评价与作用机理研究

摘要

背景 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.ylori)感染是慢性胃炎、消化性溃疡以及胃癌、胃粘膜组织淋巴瘤(MALT)等疾病的重要致病因素，世界卫生组织已将其列为一类致癌因子。对于Hp的治疗，现阶段临床上主要应用抗生素加H<'+>拮抗剂或铋剂的三联疗法，但存在明显不足，包括疗效欠稳定，易复发与再感染；易产生耐药性；医疗费用较高等。其中Hp对抗菌药物产生耐药性是导致抗Hp感染治疗失败的重要原因。因此，研究者致力于寻求高效低毒不易产生耐药性的新药与新方法。 乳香胶(Mastic Gum，MG)是从漆树科植物粘胶乳香树的根和叶中获得的一种树脂渗出液，为多种成份的混合物，在许多国家被作为食品添加剂使用。研究认为它无毒无刺激，没有明显的副作用，对Hp感染所致胃溃疡有治疗作用。体外研究发现MG内有抗菌成份，而具体是哪一种或者哪几种成份发挥对Hp的治疗作用还未见报道。 目的 通过文献调研，从已发现的未做抗Hp研究的MG成份中选择多种成份，进行抗Hp作用的体外实验研究，在此基础上进行单个成份体内清除治疗Hp的实验，以期发现有效的抗Hp候选药物。并对所筛选到的单体成份进行耐药诱导与消除实验、联合药物敏感实验及初步的毒理学评价；同时，通过形态结构观察和粘附抑制实验，探讨其抗Hp的作用机制，为进一步研究打下基础。 方法 1．采用纸片扩散法和肉汤稀释法进行10种乳香胶活性成份(α-萜品醇、马鞭草烯酮、芳樟醇、柠檬烯、β-石竹烯、甲基异丁子香酚、γ-萜品烯、反式茴香烯、香叶烯、麝子油醇)抗Hp的体外抑菌实验，初筛出药效较好成份测定其MIC和MBC。在此基础上，对MIC值最小的成份进行MIC<,50>、MIC<,90>．、MBC<,50>、MBC<,90>的测定。 2．应用Hp感染动物模型，用PCR法、培养法、病理学方法检测Hp的感染率。用筛选出的候选成份进行Hp清除治疗试验，并以临床一线三联疗法(奥美拉唑+克拉霉素+甲硝唑)为阳性药物对照，以溶剂为阴性对照，每组20只BALB/c小鼠，每天1次，连续灌胃14天。分别在用药的第8天，停药后1天，停药后30天，检测Hp的清除率，从而判断药物治疗效果。进一步对药物效果最好的组份进行剂量分组治疗，同上方法处理，确立其有效剂量。 3．药物特性与毒理学研究。将上面筛到的药物效果最佳的组份在1/2MIC的含该成份平板上连续传代14代，用肉汤稀释法监测其MIC值的变化，观察该成份的诱导耐药性；将诱导耐药株在不含药物的平板上连续传代14代，用肉汤稀释法监测其MIC值的变化，观察耐药的稳定性；肉汤稀释法检测反式茴香烯对诱导耐药株的敏感性，观察其交叉耐药性；采用试管棋盘方阵法进行三种药效最佳成份的体外联合药物敏感实验；将反式茴香烯于4℃、常温(25℃)、37℃存放18个月，监测药物对Hp的MIC值变化。最大限量实验法结合LD<,50>)法，观察该成份对BALB/c小鼠的急性毒性，记录小鼠的一般状况，死亡状况和病理解剖状况，评价其安全性。 4．液体培养Hp，加入反式茴香烯，分别用光镜和电镜观察其作用后Hp形态和结构的变化；培养胃上皮细胞GES-1细胞，在生长至80％时，分别加入Hp和经1/2MIC浓度该成份处理5h的Hp，油镜下观察Hp与GES-1的粘附作用。 结果 1．所选择的10种成份中，除香叶烯和麝子油醇外，均有一定抑菌效果，其中β-石竹烯、芳樟醇、γ-萜品烯、α-萜品醇、反式茴香烯效果明显，它们对Hp NCTC11637的MIC分别为625μg/ml、156μg/ml、156μg/ml、625μg/ml、39μg/ml；药效最好的三种药物为芳樟醇、γ-萜品烯和反式茴香烯；反式茴香烯对Hp的MIC<,50>为39μg/ml，MIC90为78μg/ml，MBC<,50>为78μg/ml，MBC<,90>为156μg/ml。 2．Hp感染BALB/c小鼠动物模型的感染率达100％(8/8)。治疗第8d，芳樟醇组和γ-萜品烯组的清除率和溶剂对照组没有显著差异(P>0.05)，反式茴香组和阳性药物对照组的清除率和溶剂对照组有显著差异(P<0．05)；停药后第1d，停药后第30d，各治疗组与溶剂对照组均有显著性差异。在治疗的第8d，各治疗组的清除率均低于50％(3/6)；而在停药后第1d，其清除率均超过66．7％(4/6)，γ-萜品烯和反式茴香烯甚至达到83.3％(5/6)；停药后第30d，三种候选单体药物组的清除率与停药后第1d相比无显著差别(P<0.05)。进一步进行的反式茴香烯抗Hp有效剂量研究，结果显示反式茴香烯对Hp的清除治疗效果和药物剂量成正相关，其在250mg/kg时清除治疗效果和阳性药物对照组相同。 3．药物特性与毒理学研究结果。耐药诱导实验发现反式茴香烯连续诱导14代未能诱导出Hp的耐药株，且其对甲硝唑诱导的耐药株仍有效；对药效尤其明显的芳樟醇、γ-萜品烯和反式茴香烯进行联合药物敏感实验，其FIC值分别为1.5、2．0、1.5，相互作用为无关作用；于4℃、常温(25℃)、37℃存放18个月，反式茴香烯对Hp的MIC值不变；急性口服毒性实验表明，芳樟醇、γ-萜品烯和反式茴香烯的LD<,50>均小于5000 mg/kg；反式茴香烯的LD<,50>为3086 mg/kg，治疗指数TI>20.6。在低剂量时，肝肾功能及胃肠未见明显变化，剂量达5000mg/kg时，可见谷丙转氨酶、谷草转氨酶明显升高，肺部出现病理改变。 4．光镜和电镜下观察发现，反式茴香烯作用后Hp形态和结构发生变化，Hp细胞肿胀坏死，细胞膜破裂甚至缺失，导致内容物溢出，且随着作用时间的延长，变化越来越明显；Hp粘附实验显示，经反式茴香烯处理后的Hp失去其与胃上皮细胞的粘附能力。 结论 1．芳樟醇、γ-萜品烯和反式茴香烯为MG中的抗Hp有效组份，均有良好的体内外抗Hp活性，其中反式茴香烯尤为突出，可以作为Hp治疗的候选替代药物进一步研究。 2．反式茴香烯不易诱导Hp耐药，与甲硝唑无交叉耐药性，于4℃、常温(25℃)、37℃存放时，其抗Hp活性稳定。 3．反式茴香烯作为抗Hp药物的剂量使用在BALB/c小鼠中没有急性毒性，使用安全；超高剂量时导致肝损伤。 4．反式茴香烯可能通过多种机制发挥抗Hp作用，包括影响细胞臊通透性，阻断Hp与胃上皮细胞的粘附等。

目录

论文说明：英文缩略词对照表

声明

摘要

前言

第一部分MG抗幽门螺杆菌活性成份体外筛选实验

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

第二部分MG抗幽门螺杆菌活性成份体内鉴定实验

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

第三部分反式茴香烯的药物特性与毒理学研究

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

第四部分反式茴香烯抗幽门螺杆菌的机制研究

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

全文总结

致 谢

照 片

参考文献

文献综述幽门螺杆菌的研究现状

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