免疫PCR检测HIV-1 p24的实验研究

摘要

目的： 建立以金磁微粒为载体，生物素-链亲和素为桥联系统的单．双抗夹心免疫PCRHIV-1 p24．检测体系，优化体系中影响检测敏感性和特异性的主要环节，讨论免疫PCR检测HIV-1 p24的灵敏度、特异性、重复性及非特异性扩增信号的处理，并与传统ELISA检测进行了灵敏度的比较，探讨检测临床标本的可行性。 方法： 1.以甘蓝型油菜肉桂酰辅酶A还原酶基因的一个片段为标记DNA，以质粒pMD18-T为克隆载体，转入大肠杆菌DH5α中，以TE Buffer(pH8.0)为介质热裂解法提取重组菌质粒DNA作为PCR扩增模板。 2．以重组菌质粒DNA为模板，用生物素标记的引物通过PCR扩增预先制备出生物素单标的报告DNA分子，并选择扩增效率及特异性高的PCR反应条件。 3．以鼠抗HIV-1 p24单克隆抗体作为捕获抗体包被金磁微粒载体，以生物素化的羊抗p24多克隆抗体作为检测抗体，通过链亲和素的桥联用报告DNA分子标记生物素化的检测抗体。被捕获抗体和检测抗体夹心捕获的HIV-1 p24抗原通过PCR扩增报告DNA的方式予以检测。 4．优化免疫：PCR的检测条件，对链亲和素浓度、报告DNA用量、封闭剂组分以及洗涤液成分和洗涤次数等指标进行最佳条件的选择。 5．讨论免疫PCR检测HIV-1 p24的灵敏度、特异性、重复性，对扩增条带进行荧光密度值(FI)定量，确定特异性扩增下限的判定标准，并与传统ELISA法进行了灵敏度的比较。 结果： 1．建立了以金磁微粒为载体，生物素-链亲和素为桥联系统，凝胶电泳法为报告DNA检测手段的单一双抗夹心免疫PCR检测技术。 2．制备报告DNA的PCR反应体系： P10.8μmol/L，P2 0.8μmol/L，MgCl<,2>2.5mmol/L，dNTP(each)0.25mmol/L，Taq酶2.5×10<'4>U/L，模板用量为PCR总体积的1/25：PCR扩增条件：三步法，94℃变性，55℃退火，72℃延伸，35循环。 3．金磁微粒上偶联抗体的效率可达95％以上，偶联抗体的一致性较好，几乎不产生非特异性吸附，分离与洗涤步骤更简便更彻底。 4．确定了捕获抗体浓度1μg/ml，检测抗体浓度0.8μg/ml，链亲和素浓度0.1mg/L，报告DNA浓度10ng/L，洗涤液为含150mmol/LNaCl的PBST，洗涤次数8次等免疫PCR检测的最佳条件。用优化后的免疫PCR体系检测出了低浓度的HIV-1 p24抗原。 5．荧光密度值(FI)大于17741判定为特异性扩增的下限(阳性信号)。免疫PCR体系检测HIV-1 p24的灵敏度可达0.1ng/L，ELISA法检测HIV-1 p24的灵敏度为1.5μg/L，免疫PCR法检测的灵敏度比ELISA法高1.5x10<'4>倍，检测的特异性和重复性较好。 结论： 1．金磁微粒为反应载体、生物素-链亲和素为桥联系统、生物素单标的双链DNA报告分子为指示系统的单-多抗夹心免疫PCR检测系统简单、合理，能在拥有标准设备的实验室中应用。 2．用TE Buffer 裂解法提取重组菌质粒DNA作为报告 DNA的扩增模板，方法快速简便，模板可保存较长时间。制备报告DNA的 PCR反应条件经优化后提高了扩增效率。此PCR反应条件既是制备生物素单标的报告DNA的扩增条件又是免疫PCR法检测HIV-1 p24时报告DNA的检测条件。 3．金磁微粒作为免疫PCR体系的反应载体偶联抗体的一致性、特异性较好，敏感性高，反应快速稳定，分离与洗涤步骤更简便更彻底，是一种较理想的免疫PCR反应载体。 4．免疫PCR检测中，链亲和素浓度、报告 DNA用量、封闭剂组分以及洗涤液成分和洗涤次数等各环节指标都会影响检测的敏感性、特异性和重复性，应该针对特定的靶物质如HIVp24抗原摸索出最佳反应条件。 5．建立的以金磁微粒为反应载体的免疫PCR检测系统实现了对低浓度HIV-1 p24．抗原的检测。检测灵敏度高，且特异性、重复性较好，将非特异性扩增的本底信号进行适当处理后能够初步满足HIV-1 p24抗原检测的要求，可能成为血清中HIV-1 p24抗原检测的有效手段。

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摘要

前 言

第一部分HIV-1 p24免疫PCR检测体系的建立

实验设计

材料与方法

结 果

讨论

第二部分免疫PCR检测HIV-1 p24的初步应用

实验设计

材料与方法

结 果

讨论

参考文献

研究总结

致 谢

文献综述免疫PCR技术研究进展及临床应用

攻读学位期间发表的论文